苹果酸脱氢酶(MDH)是一种氧化还原酶,其正反应可催化L-苹果酸和辅酶NAD+氧化形成草酰乙酸,逆反应可催化草酰乙酸以及辅酶NADH合成L-苹果酸。同时MDH在食品、临床医药和农业生产等领域,都具有非常重要的应用。由于目前国内的MDH酶制剂价格昂贵,且大多来自于动物心脏,存在提取复杂且容易造成环境污染等问题,故从丰富的海洋微生物中,提取MDH具有重要的意义。独特海洋环境造就具有耐盐、嗜热、嗜冷、耐压和耐酸、耐碱等特性的极端酶。海洋微生物在新基因、新蛋白开发等方面的应用潜力极大,为从海洋菌株中挖掘MDH基因,并构建相应的工程菌株,从而进行以下实验:(1)目标菌株的筛选。从实验室保存的14株由国家海洋局第三研究所馈赠的海洋菌菌株出发,筛选出1株MDH酶活最高的野生型菌株Pseudomonas beteli。(2)构建表达MDH的重组大肠杆菌。以Pseudomonas beteli基因组为模板,克隆出MDH基因,并连接至载体pET-28a,转化至E.coli BL21(DE3)和E.coli Rosetta(DE3),得到表达MDH的工程菌。(3)MDH酶促反应最适条件和稳定性的考察。重组菌株Rosetta-pET28a-MDH通过诱导,产生目的蛋白MDH并通过镍柱进行蛋白纯化,纯化后MDH的比酶活为31.3U/mg。MDH酶促反应最适温度为60℃,40℃以下孵育1h,酶活都能保持在60%以上。最适酶促反应pH为8.0,40℃孵育1 h,MDH在pH=7.0时最为稳定。(4)培养基优化。以苹果酸脱氢酶高产菌株Rosetta-pET28a-MDH为发酵菌株,利用PB实验以及均匀设计实验,结合DPS数据处理系统对其培养基组成进行优化,最终确定了其最佳的培养基成分(g/L):葡萄糖10,酵母粉37.5,磷酸氢二钾8.0,磷酸二氢钠2.5,硫酸铵1.4,EDTA0.5,微量元素1.1。(5)多阶段调控50L高密度发酵。接种前维持转速200rpm和溶氧值40%左右。第一阶段:在接种后,采用与通气量偶联的方法调节转速,维持通气量不变,转速最高达500rpm,设置溶氧值为30%,温度37℃。第二阶段:采用与通气量偶联的方法调节通气量,转速维持在500 rpm不变,系统自动调节通气量,设置溶氧值为30%,温度37℃。第三阶段:当发酵液的OD值达到10～11时,加入IPTG,进行诱导,维持转速500 rpm,设置溶氧值为30%,温度20℃。发酵过程中,采用恒pH补料方法,每隔1～2h收集30ml发酵液。测定其OD值最高达15.1,苹果酸脱氢酶的粗酶比酶活和粗酶酶活分别为67.5U/mg和41.0 U/ml,1L的发酵液含有酶活41000U。