研究背景和目的：喉癌是上呼吸道常见恶性肿瘤。喉癌患者的生存率并未随着近三十年来医疗技术的进步而明显改善。部分晚期喉癌患者失去了根治性手术的机会,治疗需要依靠放化疗,该部分患者生存率较低。因此,应用现代分子生物学技术,探讨高效低毒的喉癌治疗新方法具有临床实际意义。基因治疗作为生物治疗的重要组成部分,已经广泛应用于肿瘤治疗的研究,它能否为喉癌的治疗带来了新的希望值得研究探讨。腺病毒是基因治疗中常用的基因载体,通过肿瘤特异性启动子调控目的基因的表达,可以实现重组腺病毒对肿瘤组织的靶向性。在前期的研究中,我们证实了分泌性白细胞蛋白酶抑制因子(Secretory Leukoprotease Inhibitor, SLPI)启动子调控的重组腺病毒具有良好的喉癌组织靶向性。细胞的增殖失控和凋亡受阻共同促成恶性肿瘤的发生发展。因此肿瘤基因治疗可以从抑制细胞增殖和促进细胞凋亡两方面着手。表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR)在头颈部鳞状细胞癌(Head and Neck Squamous CellCarcinoma, HNSCC)中过度表达,是其恶性表现的重要分子机制之一,与肿瘤的生长、转移及疾病预后关系密切。EGFR是近年来HNSCC生物治疗的热门靶点。分子靶向药物易因EGFR过表达、降解障碍和靶点突变等原因导致耐药。通过RNA干扰技术可以下调EGFR的表达从而抑制肿瘤细胞增殖,并可避免上述耐药现象。天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)在细胞凋亡信号传递中居核心地位。重组活化型Caspase-3(revCasp3)是由人体天然Caspase-3经人工重组而来,它不需上游分子的切割活化就能自发折叠成活性状态,直接诱导细胞凋亡。前期研究发现,用SLPI启动子调控重组活化型Caspase-3在喉癌细胞中表达能够特异性有效抑制喉癌。本文设计以重组腺病毒为载体,用喉癌特异性的SLPI启动子调控以EGFR为靶点的人工nicroRNA和重组活化型Caspase-3,与临床一线药物顺铂(DDP)和西妥昔单抗(Cetuximab)相比较,研究该重组腺病毒对人喉鳞状细胞癌细胞株Hep-2的体、内外抑制作用,探讨该双向途经基因治疗策略抑制喉癌的效果。方法：1.构建腺病毒穿梭质粒pDC312-SLPI-EGFRamiR-pA-SLPI-revCasp3-TAG-pA和pDC312-SLPI-GFP-pA,分别与骨架质粒pBGHlox(delta)E1,3Cre共转染HEK293细胞进行腺病毒包装。PCR鉴定重组腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR-SLPI-revCasp3(简写为Ad-EC),和Ad-SLPI-GFP (简写为Ad-GFP)。扩增病毒,CsCl密度梯度离心法纯化病毒,TCID50法测定病毒滴度。病毒分别感染Hep-2细胞和人正常成纤维细胞(Normal Fibroblast, NF),用荧光显微镜、流式细胞仪和Western blot检测目的基因的表达。2.将Ad-EC、Ad-GFP、DDP、Cetuximab以及Ad-EC+DDP合用分别作用于Hep-2,用MTT,流式细胞仪和iCELLigence实时无标记动态细胞分析技术(Real TimeCellular Analysis, RTCA)检测Hep-2细胞的增殖和凋亡,用、Vestern blot检测相关蛋白的表达水平。3.建立喉癌荷瘤裸鼠模型,分为Ad-EC、Ad-GFP、DDP、Cetuximab、Ad-EC+DDP以及PBS六个处理组,比较用药过程中各组肿瘤体积变化、体重变化及观察末期瘤体重量。microPET检测每组活体肿瘤的代谢情况。结果：1重组腺病毒的构建腺病毒穿梭质粒构建成功后与骨架质粒共转染HEK293细胞,13天左右出毒,PCR检测示Ad-EC扩增出revCasp3大小亚基879bp片段,Ad-GFP扩增出1482bp片段,示重组腺病毒Ad-EC及对照病毒Ad-GFP构建成功。予扩增、纯化后行滴度测定,Ad-EC滴度为6.3×109pfu/ml, Ad-GFP为3.89×101pfu/ml。重组腺病毒Ad-GFP感染72小时后,荧光显微镜下可见大量Hep-2细胞呈现较强的绿色荧光信号,而NF细胞无明显绿色荧光；流式细胞仪检测见Hep-2细胞绿色荧光阳性率45%,NF细胞仅12%。Western blot结果显示Ad-EC病毒作用72小时的Hep-2细胞EGFR蛋白表达减少,活化Caspase-3表达增多；而在NF细胞中无如上变化。表明SLPI启动子能够调控目的基因在Hep-2细胞中特异性表达。72小时为合适的感染时间。2重组腺病毒对人喉鳞状细胞癌细胞株Hep-2的体外抑制作用2.1细胞增殖抑制实验MTT结果显示,重组腺病毒Ad-EC对Hep-2的增殖有较强的抑制作用且呈量效关系,MOI50感染72小时的抑制率为44.0%。DDP对Hep-2有较强的抑制作用,当其与Ad-EC合用时,效果明显升高。Cetuximab和Ad-GFP对Hep-2的增殖抑制作用均较低。2.2流式细胞仪定量分析细胞凋亡Ad-EC MOI50感染Hep-272hr后能显著诱导Hep-2凋亡(凋亡率36.1%),并且明显高于其他单用组,P均<0.001(DDP0.25μg/ml组凋亡率13.5%；Cetuximab500μg/ml组为3.5%；Ad-GFP MOI50组为6.5%)。而当与DDP合用时,凋亡率提高至61.2%,显著高于Ad-EC和DDP单用组(P均<0.001)。2.3用iCELLigence实时无标记细胞功能分析(RTCA)技术实时检测Hep-2细胞生长情况Cell index(CI)值反映培养皿底部的电极因细胞贴壁形成的阻抗变化。Ad-ECMOI50组平台期CI值为3.3-3.5,DDP0.25μg/ml组为2.8-3.0,均低于阴性对照组3.5-3.7,表现出一定的生长抑制作用；在Ad-EC+DDP合用组,CI值从用药36hr后的最高值3.7持续滑落,一直到96hr结束检测时的1.0,并仍保持下降趋势,提示合用组具有更高效的细胞毒性作用。2.4Western blot检测相关蛋白的表达Ad-EC MOI50感染Hep-2细胞72hr后能使EGFR表达下调,活化Caspase-3表达升高及PARP (poly ADP-ribose polymerase)剪切增多。在与DDP合用时上述变化更显著。3喉癌荷瘤模型的肿瘤生长抑制作用Ad-EC以MOI50瘤内注射,与PBS对照组相比,用药30天后肿瘤体积和瘤重明显降低(P<0.05),葡萄糖摄取减少,而裸鼠体重、日常行为等与对照组相仿。DDP组肿瘤体积和瘤重较对照组显著降低(P<0.05),但裸鼠体重较对照组减轻(P<0.05)。Ad-EC与DDP合用后加强了肿瘤抑制作用,然而对裸鼠体重增长的影响也较DDP组更加明显(P<0.05)。结论：1.荷载有SLPI启动子调控下的针对EGFR的人工microRNA和重组活化型Caspase-3的重组腺病毒Ad-EC构建成功。2.体外实验显示重组腺病毒Ad-EC能有效抑制喉癌细胞的生长和诱导细胞凋亡,且呈剂量相关,与DDP合用可提高抑瘤作用；3.应用荷瘤裸鼠模型的体内实验显示,重组腺病毒Ad-EC明显抑制肿瘤生长,与DDP合用时抑瘤作用增强。