研究背景偏头痛是原发性头痛常见类型之一,表现为发复发作的、单侧或双侧、中重度搏动样头痛,常伴有恶心、呕吐,声、光刺激和日常活动均可使头痛加重,少部分患者头痛发作前有视觉、感觉或者运动性先兆表现。2011年《中国偏头痛诊断治疗指南》报道我国偏头痛年患病率女性为3.3%～32.6%,男性为0.7%～16.1%。2012年流行病学调查显示我国偏头痛年患病率为9.3%。该病发病率高,治愈率低,目前缺乏安全有效的治疗措施,严重影响患者的生活质量。2010年全球疾病负担调查将偏头痛列为全球第七位高致残性疾病。三叉神经血管反射学说是目前研究偏头痛发病机制的主流学说,它将神经、血管、递质三者相结合,主要涉及三种机制:供应脑膜的颅内外血管扩张、血管周围神经释放血管活性物质引起神经源性炎症以及中枢痛觉传导的抑制降低。三叉神经血管系统的激活和致敏是偏头痛发生的关键环节。即刻早期基因c-fos的表达阳性是神经元激活的标志物,其在三叉神经脊束核尾侧部有丰富表达,当细胞受到刺激后细胞核内的c-fos转移至胞浆并翻译为fos蛋白,对fos蛋白进行检测可以间接的反应机能相关的细胞在脑内的分布。最近研究发现细胞外信号调节激酶(extracellular signal-egulatedkinase,ERK)的调节是治疗神经病理性痛的新靶点,偏头痛是神经病理性疼痛中的一种[1]。ERK/MAPK参与多种神经可塑性变化如痛觉的产生和维持[2,3],ERK/MAPK的激活对于神经性疼痛的发展和维持是必须的。瞬时受体电位香草酸亚型1(transient receptor potential vanilloid 1,TRPV1 受体)和嘌呤能受体 P2X3 受体,均为非选择性阳离子通道,二者均高表达于与疼痛相关的中、小直径感觉神经元上,在三叉神经感觉神经元有丰富表达。P2X3受体和TRPV1受体之间存在交互抑制作用,二者又均可以促进ERK的磷酸化,c-fos作为ERK信号通路的目的基因,四者之间相互联系。当偏头痛发作时,三叉神经感觉神经元的P2X3,TRPV1,ERK和c-fos均表达明显上调。目前西医对偏头痛的治疗还没有疗效确切的根治性治疗方法,只能是控制急性发作和预防性用药。偏头痛的药物治疗包括急性发作期治疗和预防性治疗,急性发作期治疗药物分为特异性药物[麦角胺类衍生物、曲坦类药物、降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)受体拮抗剂]及非特异性药物[非甾体抗炎药、巴比妥类镇静药、阿片类等]两类。然而研究表明,曲坦类药物和麦角碱类药物不良反应均较多,且不能用于儿童及青少年,非留体抗炎药存在胃肠道不良反应及出血风险,目前应用于偏头痛预防性治疗的药物主要包括:β受体阻滞剂、钙离子通道阻滞剂、抗癫痫剂、抗抑郁剂、非甾体抗炎药等,也有诸多不良反应和禁忌症。偏头痛属于中医学“头痛”、“头风”、“偏头痛”、“偏头风”等的范畴,导师陈宝田教授根据历代医书对偏头痛的记载,结合其多年临床经验将偏头痛的病因病机概括为风、湿、瘀、虚四个方面,并于1985年创制正天丸,该方由川芎茶调散、麻黄附子细辛汤、桃红四物汤、四藤消震饮四大头痛古方化裁而成,由川芎、钩藤、白芍、生地黄、当归、桃仁、红花、白芷、麻黄、附子、细辛、防风、羌活、独活、鸡血藤等中药组成,以川芎和钩藤为君药,具有疏风活血、养血平肝、通络止痛等功效,可用于治疗外感风邪、瘀血阻络、血虚失养、肝阳上亢引起的偏头痛、紧张性头痛、神经性头痛、颈椎病型头痛、经前头痛等各种头痛。临床应用近30余年,是目前治疗偏头痛的国家基本药物,并已远销海外,年销售约5亿元人民币,为国家带来了较高的社会效益和经济效益。临床随机对照双盲多中心研究显示,正天丸能显著减轻偏头痛的发作强度、程度,降低发作频率,缩短头痛持续时间,临床疗效确切,病人耐受性好,且无明显不良反应。但目前对正天丸治疗偏头痛的研究仍停留在临床疗效观察和简单的药效学评价上,对正天丸发挥作用的微观生物调控网络认识不足,尤其对新近发现的偏头痛发病机制中细胞因子的影响研究较少。正天丸现阶段的研究不足,使其难以获得国际医学界的认可,制约了正天丸治疗偏头痛的国际化道路。因此我们对近年来认为在痛觉信息传递过程中起重要作用的P2X3受体、TRPV1受体和ERK信号通路进行研究,以明确正天丸是否也通过影响它们的表达从而发挥对偏头痛的抑制作用。川芎嗪是从正天丸的主药川芎中提取的主要生物碱单体:4-甲基吡嗪(tertramethylpyrazine,TMP),亦是正天丸的主要有效成分,为一种典型的钙离子拮抗剂,可以通过抑制初级感觉神经元P2X3受体和ERK信号通路过表达,对大鼠足底急性伤害性反应、坐骨神经慢性压迫性损伤和烧伤痛等多种急慢性疼痛起到明显抑制作用。有关川芎嗪治疗偏头痛的临床报道较多,但实验研究很少,川芎嗪的具体作用机制尚不清楚,因此我们对偏头痛大鼠三叉神经感觉神经元的P2X3受体、TRPV1受体、ERK信号通路和c-fos进行检测,以明确川芎嗪对偏头痛的抑制作用是否也通过影响它们的表达。研究目的通过制作具有代表意义的经典偏头痛动物模型,采用多种实验技术手段,从行为学、蛋白和基因水平观察正天丸和川芎嗪对实验性偏头痛大鼠模型三叉神经血管系统中c-fos、ERK、TRPV1和P2X3表达的影响,从而为阐明正天丸和川芎嗪治疗偏头痛的止痛作用机制提供实验数据,为中药复方制剂的临床应用奠定坚实的科学的理论基础,促进中医药理论的现代化和国际化,使正天丸产生更好的社会效益和经济效益。研究方法1硝酸甘油偏头痛大鼠模型的制备和行为学观察SD雄性大鼠,采用随机数字表法将其分为:对照组、模型组、正天丸组、川芎嗪组。正天丸组给予1.62 g·kg-1·d-1正天丸灌胃,对照组和模型组大鼠给予1 ml·d-1 0.9%氯化钠溶液灌胃,川芎嗪组给予盐酸川芎嗪注射液用生理盐水稀释后腹腔注射,剂量为100 mg·kg-1·d-1,各组大鼠连续给药7 d。模型组、正天丸组、川芎嗪组大鼠末次给药30 min后,皮下注射10 mg·kg-1硝酸甘油注射剂制备实验性偏头痛动物模型,对照组大鼠同期皮下注射0.5 ml 0.9%氯化钠溶液。以大鼠出现耳朵发红、前肢频繁挠头、爬笼、烦躁不安等行为视为造模成功。观察指标为:(1)皮下注射硝酸甘油后耳红出现时间和耳红消失时间;(2)皮下注射硝酸甘油后挠头开始时间和挠头结束时间:挠头开始时间以大鼠出现连续挠头达5次以上为标志,挠头结束时间以30 min内大鼠挠头次数不足5次且表现倦怠、疲乏状态为标志。(3)皮下注射硝酸甘油后各时间段内大鼠爬笼次数:采用持续时间分段计数的方法,以每30分钟作为一个时间段进行观察,观察时间持续至造模后3小时,挠头停止时间以单个时间段内挠头次数低于5次为标志。2标本采集与指标检测2.1免疫荧光技术各组大鼠造模4 h后10%水合氯醛麻醉,4%多聚甲醛灌注固定,石蜡包埋切片。切片进行脱蜡和水化、热抗原修复、灭火内源性过氧化物酶后,滴加5%牛血清清蛋白(BSA)封闭液封闭15 min以封闭非特异性抗原,随后加入一抗,4 ℃环境下过夜。滴加荧光二抗,避光孵育1 h,每个环节间均用磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗5 min×3次,加抗淬灭剂,中性树胶封固,倒置荧光显微镜下观察结果,红色荧光颗粒为标记的目的蛋白,对照组以PBS作为一抗。2.2蛋白免疫印迹法(Western blotting)各组大鼠造模4 h后行10%水合氯醛麻醉,迅速冰上取材,-80 ℃液氮保存。取样本50 mg进行液氮研磨,加入150 μl RIPA裂解液及1.5 μ1苯甲基磺酰氟(PMSF)冰上孵育 30min,4 ℃ 1500r·mim-1 离心 15min(离心半径 13.5 cm)。取上清液,BCA法测定蛋白浓度。每个样本各取50μg进行SDS-PAGE电泳,转PDVF膜,5%脱脂牛奶室温封闭1h,TBST冲洗3次,加入一抗,4。℃孵育过夜,加入二抗室温孵育1 h,ECL化学发光法在IS 2000 MM成像系统(Kodak)进行曝光拍照,柯达2000MM图像工作软件分析条带灰度值,以β-actin作为内参,每组重复检测3次。2.3 RT-PCR检测法各组大鼠造模4 h后行10%水合氯醛麻醉,迅速冰上取材。按照试剂盒说明书进行各样本总RNA的提取和cDNA的转录,以管家基因GAPDH为内参照。引物由上海英骏生物技术有限公司合成,引物序列如下:P2X3:上游引物:5’-TCTTGAGGGTAGGGGATGTG-3’,下游引物5’-CAC ACCCAGCCGATCTTAAT-3’;TRPV1:上游引物:5’-TGACTACCGGTGGTGTTTCA-3’,下游引物:5’-GCTGGGTGGC ATGTCTATCT-3’;GAPDH:上游引物:5’-ATTCTCAGCAATGCATC-3’,下游引物 5’-ATGGACTGTGGtcATGAGCC-3’。共25 μl反应体系:12.5ulSYBR核心mix,10.5ulDEPC水,lulcDNA模板,0.5ulP2X3/TRPV1 上游引物,0.5ulP2X3/TRPVl 下游引物。PCR 反应条件:95℃l0min,95℃10s,60℃ 30s,72。C反应 30s,共 40 个循环。PCR 仪读取内参GAPDH和P2X3的循环阈值,采用相对定量法(2-ΔΔCT)计算各样本P2X3mRNA的ΔCT值。3统计分析采用SPSS13.0软件组行统计分析,计量资料以x±s表示,首先进行方差齐性检验,方差齐时采用单向方差分析或t检验进行组间比较,不齐时采用Welch近似方差分析法进行组间比较;整体组间比较有差异时,进一步采用Bonferroni法(方差齐时用)或Dunnett’sT3法(方差不齐用)进行各组均数的多重比较,以P<0.05为差异有统计学意义。结果1对照组皮下注射生理盐水后除开始30 min内挠头和爬笼现象稍明显外,其余时间段未见明显异常活动,无耳红表现。模型组、正天丸组和川芎嗪组大鼠皮下注射硝酸甘油造模后4min左右,即出现耳红、频繁挠头、爬笼等现象,此现象在造模后30～90min达高峰,持续约2～3小时。模型组、正天丸组和川芎嗪组之间挠头开始时间和耳红出现时间比较均无统计学差异(P=0.495,P=0.830)。模型组的挠头结束时间较正天丸组和川芎嗪组均较长(P<0.001),正天丸组和川芎嗪组之间挠头结束时间比较无统计学差异(P<0.001),模型组耳红持续时间较正天丸组和川芎嗪组明显长(P<0.001)。正天丸组和川芎嗪组在给药后各时间段内爬笼次数较模型组明显减少(P<0.001)。2免疫荧光结果显示:各组大鼠三叉神经节(trigeminal ganglion,TG)神经元均有不同程度c-fos、P2X3、TRPV1阳性表达,在细胞质中呈均匀表达状态,在细胞核内无表达,主要位于中小直径神经元。对照组在正常状态下也有少量阳性表达,模型组表达强度明显较对照组高,正天丸组和川芎嗪组表达强度较模型组降低。3免疫荧光结果显示:各组大鼠三叉神经脊束和三叉神经脊束核尾侧亚核均有不同程度c-fos、P2X3、TRPV1阳性表达,模型组表达强度高于其余各组。4 Western blotting结果显示:各组大鼠三叉神经节和三叉神经颈髓复合体中ERK、P2X3、TRPV1蛋白表达结果显示,模型组蛋白表达较空白组明显升高(P<0.05),正天丸组和川芎嗪组蛋白表达较模型组明显降低(P<0.05)。5 RT-PCR结果显示:模型组大鼠三叉神经节和三叉神经颈髓复合体中TRPV1 mRNA,P2X3mRNA表达水平较对照组明显增加(P<0.05),正天丸组和川芎嗪组较模型组降低(P<0.05)。结论1.正天丸和川芎嗪可以抑制硝酸甘油诱导的偏头痛大鼠模型的行为学表现,可以缩短偏头痛大鼠的爬笼、挠头、耳红的持续时间,减少单位时间内爬笼、挠头的发作频率,且正天丸对行为学的抑制作用优于川芎嗪。由此可知正天丸和川芎嗪可以缩短偏头痛发作时的头痛持续时间,降低发作程度。2.c-Fos、ERK、P2X3、TRPV1在硝酸甘油诱发的偏头痛大鼠的三叉神经颈髓复合体和三叉神经节均有丰富表达。3.正天丸和川芎嗪可以抑制硝酸甘油偏头痛大鼠三叉神经颈髓复合体和三叉神经节中c-Fos、ERK、P2X3、TRPV1的过表达。4.正天丸与川芎嗪对偏头痛的抑制作用可能为同时作用于P2X3、TRPV1、ERK和c-fos多个位点,亦或许是通过抑制P2X3和TRPV1的表达,进而影响下游ERK信号通路的活化。