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目的:免疫治疗是近10年来肺癌治疗的一大突破,多种免疫检查点抑制剂目前已获批应用于肺癌,特别是晚期肺癌的临床治疗,为晚期肺部肿瘤患者带来了曙光。其作用机制在于唤醒免疫微环境中被封锁的淋巴细胞,发挥自身抗肿瘤免疫功能。然而尽管其疗效显著,部分患者可能达到“治愈”的效果,但免疫治疗的有效率仅约20-40%。究其原因,主要是各种原因导致的免疫细胞活力下降,机体抗肿瘤免疫力再次被封锁。因此,对于肺癌的治疗,我们需要进一步探索并研发新的有效药物,尤其是那种能够抑制肿瘤细胞生长的同时可增加机体免疫原性及免疫细胞活性,从而激发机体抗肿瘤免疫应答,甚至可能增强免疫检查点抑制剂的疗效及逆转其耐药问题。蛋氨酸脑啡肽（MENK）是一种由酪氨酸-甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-蛋氨酸五个氨基酸残基构成的内源性阿片样物质,主要来源是肾上腺产生的前激素和前脑啡肽演变而产生。在功能上,MENK作为阿片类物质受体的内源性配体,无药物依赖性和种属特异性,是将中枢神经系统和免疫系统连接起来的重要中介。阿片受体在免疫细胞和肿瘤细胞中均有表达,其中,免疫细胞包括:树突状细胞（dendritic cells,DCs）、巨噬细胞、T淋巴细胞、自然杀伤（natural killer,NK）细胞等具有经典阿片受体的表达,适宜浓度的MENK可与免疫细胞中的阿片受体结合,发挥显著的免疫调节作用,增强抗肿瘤免疫活性;而在许多肿瘤细胞如胰腺癌细胞、肠癌细胞、胃癌细胞等多种肿瘤细胞中存在非经典阿片受体的表达,是MENK发挥直接抗肿瘤作用的主要受体。然而,MENK对于肺癌的影响,目前尚无研究报道。既往有研究发现肺癌细胞如A549、H1975细胞中也存在阿片受体的表达,而且吗啡可通过与此受体抑制肿瘤细胞的生长。所以我们推测,MENK可能对肺癌细胞的生长具有抑制作用,但是其作用机制如何,以及是否能够改变肺癌细胞免疫原性及肿瘤微环境免疫状态,需要体内外实验进一步验证。研究方法:1、体外,用不同浓度的MENK（0、1、2.5、5、7.5、10、12.5 mg/m L）分别作用于人肺癌细胞A549和H1975,以及鼠源性肺癌Lewis 24,48,72,96 h;同时,用上述浓度的MENK作用于人正常支气管上皮细胞Beas-2B 24,48 h,采用CCK-8试剂盒检测MENK的抑制效果。选出6 mg/m L MENK 48h作为适宜的作用剂量和时间进行后续肺癌细胞功能学实验。6 mg/m L MENK作用于肺癌细胞48h后,行以下检测分析:与空白对照组比较,光学显微镜观察肺癌细胞的形态改变;克隆形成实验明确克隆形成能力的改变;流式细胞术和Hoechst 33258检查肺癌凋亡情况改变,流式技术检测肺癌细胞的细胞周期改变;划痕实验和transwell侵袭实验分别检测肺癌细胞转移和侵袭能力的改变;免疫荧光检测钙网蛋白（calreticulin,CRT）膜表达和高迁移率族蛋白-1（high mobility group box 1,HMGB1）核释放的改变。之后,收集空白组和MENK给药组的肺癌细胞,提取mRNA和蛋白,qRT-PCR法检测阿片生长因子受体（opioid receptor,OGFr）以及自然杀伤细胞组2D成员配体（Natural killer group 2,member D ligands,NKG2DLs）MICA、MICB、ULBP1、H60、REA-1的mRNA表达改变,Western blot法检测OGFr蛋白表达改变。流式检测A549细胞表面MICA、MICB、ULBP1的表达。2、信号通路研究,利用OGFr-si RNA有效序列包成慢病毒,构建OGFr稳定沉默的人肺癌细胞株。随后将肺癌细胞分成三组,包括si-NC组、si-NC+MENK组、siOGFr+MENK组,qRT-PCR及Western Blot检测Wnt/β-catenin通路相关因子:cyclin D1、c-myc、β-catenin,凋亡通路相关因子:Bax、Bcl-2、caspase-3,以及上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）进程相关标记物:E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2的mRNA水平和蛋白表达水平的差异。3、体内,构建人肺癌裸鼠皮下移植瘤模型。将A549细胞皮下注射于裸鼠后背部,之后将接种成功的裸鼠随机分成两组:MENK给药组（5 mg、10 mg/次,隔天一次）和阴性对照组（等体积的NS,隔天一次）。每日测量并记录裸鼠生命体征,动态监测裸鼠体重和皮下移植瘤体积变化。用药时间大约满3周后,采用颈椎脱臼法处死裸鼠,取出皮下肿瘤组织并测量大小及称重。制备肿瘤石蜡切片,做以下检测:HE检测组织病理,免疫组化检测组织内OGFr和Ki67表达,TUNEL法检测组织凋亡改变。4、体内,构建小鼠肺癌模型来进一步明确免疫细胞的变化,于C57BL/6小鼠右侧腋下皮下接种Lewis细胞,成瘤后,将小鼠随机分成两组:MENK给药组（10 mg/次,隔天一次）和阴性对照组（等体积的NS,隔天一次）,治疗3周。之后颈椎脱臼处死小鼠,取脾及肿瘤组织,流式检测CD8+T细胞、CD4+T细胞、NK细胞、DCs,以及表达Gz B和IFN-γ阳性的NK细胞得比例。取出皮下肿瘤称重,制备肿瘤石蜡切片,以备做HE检测组织病理,免疫组化检测OGFr、Ki-67、Gz B、IFN-γ、IL-10、IL-15等蛋白的表达,免疫荧光检测免疫原性细胞死亡标记物CRT、HMGB1以及各免疫细胞表面标志CD8、CD4等蛋白的表达。结果:1、体外实验结果显示,与对照组比较,MENK可明显抑制A549、H1975和Lewis细胞的增殖,其作用具有显著的浓度和时间依赖性,而对人正常支气管上皮细胞Beas-2B上无抑制作用。MENK可将肺癌细胞阻滞于细胞周期的G0/G1期;诱导肺癌细胞发生凋亡;降低肺癌细胞的克隆形成、迁移和侵袭能力。MENK可上调OGFr表达,增加肺癌细胞表面CRT、NKG2DLs的表达和HMGB1的核释放。2、体外,沉默OGFr后,qRT-PCR及Western Blot实验结果提示:MENK可降低Wnt/β-catenin通路中cyclin D1、c-myc、β-catenin的mRNA和蛋白表达水平;MENK可调控Bcl-2/Bax/caspase-3通路相关蛋白和基因的表达,表现为MENK作用后,Bax和cleaved-caspase-3表达水平明显升高,而Bcl-2表达水平明显下降,但caspase-3的表达无明显变化;MENK可引起EMT进程相关标志物的改变,表现为于基因和蛋白水平上肺癌细胞表达的N-cadherin、Vimentin、以及MMP-2的水平明显下降,而Ecadherin的水平得以显著提升;沉默OGFr后,上述作用被明显削弱。3、MENK可抑制人肺癌裸鼠皮下移植瘤和小鼠Lewis细胞皮下移植瘤的增殖,并能够诱导移植瘤阻滞中肺癌细胞的凋亡。免疫组化实验结果提示:MENK治疗组裸鼠及小鼠肿瘤组织中OGFr表达水平明显上调,而Ki-67表达水平明显下调。HE和TUNEL染色结果均提示:MENK可诱导移植瘤组织中肺癌细胞的凋亡。4、体内,流式结果提示:MENK可增加肿瘤和脾脏组织中DCs、NK细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞的比例,同时,MENK可增加NKG2D阳性的NK细胞及CD8+T细胞亚群比例。其中NK细胞中NKG2D的表达阳性的细胞比例升高较为显著。NK细胞功能性实验进一步表明,MENK治疗组小鼠的肿瘤和脾脏组织中Gz B、IFN-γ阳性的NK细胞比例明显增加。免疫荧光结果提示:在MENK治疗组的小鼠移植瘤组织中,CRT和HMGB1蛋白的表达明显增加;CD8+、CD4+T细胞、NK细胞、M1型巨噬细胞、DCs的比例明显增加,而髓源性抑制细胞、M2型巨噬细胞比例明显下降。免疫组化结果提示:MENK治疗组小鼠肿瘤组织中IL-15、IL-21、Gz B、IFN-γ表达水平明显升高,而IL-10、TGF-β1表达水平明显下降,同时cyclin D1、c-myc、β-catenin蛋白的表达水平明显下降。结论:1、体内外实验结果均证实,MENK在适宜的剂量下可显著抑制肺癌细胞的增殖。2、MENK可通过细胞周期阻滞,诱导细胞凋亡,抑制细胞迁移和侵袭,以及可能通过增加肿瘤细胞免疫原性及重塑肿瘤微环境免疫状态,发挥抗肺癌作用。3、MENK可显著上调肺癌细胞中OGFr的表达水平,与OGFr结合后触发抗肿瘤机制,包括调控NKG2DLs-NKG2D信号通路、Bcl-2/Bax/caspase-3信号通路、Wnt/β-catenin信号通路以及EMT进程。