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Viral protein 22(VP22)是I型单纯疱疹病毒的壳皮蛋白,作为一种细胞转导肽(Cell-Penetrating Peptides, CPPs),能介导其融合蛋白进入细胞并具有细胞间穿梭功能。TAT是来自HIV的含11个氨基酸的短肽,也是一种转导肽,被广泛用于转导肽段、寡核苷酸和蛋白进入细胞。促性腺激素释放激素(gonadotrophin releasing hormone,GnRH)是下丘脑分泌的含有十个氨基酸的短肽类激素,它可以作用于垂体前叶促进促性腺激素的分泌。文献报道在乳腺多种肿瘤细胞表面都有GnRH受体分布,这为GnRH作为大分子药物载体提供了科学依据。氧依赖性降解区域(oxygen-dependent degradation domain,ODD)可以控制缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)存在与否,在常氧条件下会通过羟化特定位点的脯氨酸,进而使HIF-1α被蛋白酶降解。缺氧是实体肿瘤的特征性病理改变,含有ODD的融合蛋白可以稳定存在。蓖麻毒素A链(Ricin Toxin A Chain,RTA)是蓖麻毒素的效应链,它是一种RNA特异性的N-糖苷酶,可催化核糖体60s亚基中28S rRNA的一个高度保守的环状结构脱去一个特殊的腺嘌呤(在大鼠中为A-4324位),从而使蛋白合成功能受阻,导致细胞死亡。本课题目的是以RTA作为抑制肿瘤细胞增殖的活性分子,利用GnRH、TAT以及VP22的作用将融合蛋白转运进入肿瘤细胞,并利用ODD的降解作用减轻RTA对正常细胞的毒性,提高融合蛋白对实体瘤的靶向性作用。构建pET28a-RTA、pET28a-VP22-RTA、pET28a-GnRH-RTA、pET28a-TAT-RTA及pET28a-VP22-ODD-RTA原核表达载体,转化大肠杆菌BL21,诱导RTA融合蛋白的可溶性表达,超声裂解表达后菌体,利用融合蛋白上的组氨酸标签进行亲和层析纯化目的蛋白,在分子、肿瘤细胞和动物整体水平研究融合蛋白的肿瘤抑制活性。实验方法:应用无细胞系蛋白合成抑制实验测定融合蛋白对蛋白合成的抑制作用;SRB法测定融合蛋白对肿瘤细胞生长的抑制作用;细胞免疫荧光法、细胞免疫化学法测定融合蛋白是否可以进入肿瘤细胞以及融合蛋白在细胞中的定位;应用流式细胞术测定融合蛋白诱导肿瘤细胞凋亡。以人肺腺癌细胞系A549细胞建立Bal b/c裸鼠荷瘤模型,将建模成功的荷瘤鼠分为四组,即TC (肿瘤对照组)组,RTA组,GnRH-RTA组和TAT-RTA组,用腹腔给药的方式(实验组融合蛋白3 mg/kg/天,对照组生理盐水200μL/只/天)测定融合蛋白在体内抑制肿瘤生长的作用,同时对荷瘤小鼠的血浆生化指标进行测定初步判断融合蛋白对动物的毒副作用。实验结果:①构建了pET28a-RTA系列原核表达载体,并利用该系列载体表达出可溶性的融合蛋白。②利用融合蛋白N端的His-tag,采用亲和层析的方法进行了RTA融合蛋白的纯化。③经细胞免疫荧光、细胞免疫化学分析表明融合蛋白GnRH-RTA,TAT-RTA可以进入A549细胞、MDA-MB-231细胞和H1299细胞。④经无细胞系蛋白合成抑制实验测定表明,融合蛋白RTA、GnRH-RTA、TAT-RTA、VP22-RTA和VP22-ODD-RTA均具有明显的蛋白合成抑制活性,抑制活性由高到低依次是:VP22-ODD-RTA、VP22-RTA、RTA、TAT-RTA、GnRH-RTA。⑤经SRB法测定表明GnRH-RTA、TAT-RTA、VP22-RTA和VP22-ODD-RTA在常氧和缺氧条件下都能够有效地抑制A549细胞的增殖,并且抑制细胞生长的作用随着蛋白浓度的增加而呈增强的趋势;其中TAT-RTA较其他RTA融合蛋白的抑制作用更强,VP22-ODD-RTA在常氧和缺氧条件下对A549的生长抑制作用没有明显的差别。SRB法还测定了融合蛋白对HepG2细胞、Hela细胞、MDA-MB-231细胞以及H1299细胞的增殖抑制作用。对HepG2细胞和Hela细胞:融合蛋白在常氧条件下对细胞均有增殖抑制作用,且成剂量依赖性,在缺氧条件下也都有增殖抑制作用,但无剂量依赖性;对H1299和MDA-MB-231细胞:融合蛋白在常氧和缺氧状态下均有生长抑制作用,在蛋白浓度大于10-7M时抑制作用较明显,其中TAT-RTA的作用比其他融合蛋白显著。同样,SRB实验结果表明VP22-ODD-RTA对HepG2、Hela、MDA-MB-231以及H1299细胞的作用在常氧和缺氧条件下无明显差别。⑥流式细胞术结果显示,在常氧状态下RTA系列融合蛋白可以随时间延长增加A549细胞早期凋亡的百分率,其作用在48 h最强,与培养基对照相比,TAT-RTA在给药48 h时可显著诱导A549细胞发生早期凋亡。⑦测量、计算各组实验动物瘤体体积发现,与对照组比较RTA、GnRH-RTA、TAT-RTA显示了较好的抑制瘤体生长的趋势,但是给药期间各组的动物体重分析表明RTA和TAT-RTA对实验动物的毒性较大,导致动物体重明显下降。⑨动物血浆生化指标测定结果表明,融合蛋白对动物的肝、肾功能都有不同程度的影响,以RTA和TAT-RTA最为明显。由上述结果得出如下结论:融合蛋白GnRH-RTA、TAT-RTA在体内和体外均有明显的抑制肿瘤生长的作用,但融合蛋白TAT-RTA因为没有细胞选择性,对动物的毒性作用较大。若融合蛋白可以增加对肿瘤细胞的靶向性,则有望开发成为新型的抗肿瘤药物。