研究背景心血管疾病(CVD)和慢性肾脏疾病(CKD)是世界范围内导致残疾和死亡的重要原因。血管钙化是指钙盐在血管壁的异常沉积,血管钙化作为CKD患者的心血管并发症之一,其发病率与严重程度逐年增加,是导致CKD患者高死亡率的重要因素。血管钙化缺乏有效治疗药物,血液透析不能减缓CKD-血管钙化进程,肾脏移植对血管钙化的作用仍存在争议。因此,探寻血管钙化的发病机制及干预药物,在分子水平寻找有效的诊断和防治靶点是影响人群健康的关键,这亟需我们开展相关的基础研究工作。血管钙化的发生机制复杂,多种机制及信号通路,如细胞自噬与凋亡、Wnt/β-catenin信号通路激活、内质网应激等均参与调控了血管钙化过程。最近的研究表明,血管钙化并不只是被动的钙磷沉积,而是多种机制参与调控的复杂病理过程,这一过程类似骨形成过程。其中,血管平滑肌细胞(VSMC)的表型转换起到了至关重要的作用。钙化过程中,VSMC原有的收缩表型标志物,如α-SMA、Calponin、SM22α等表达减少,而成骨相关的转录因子,如RUNX2、Msx2、骨膜蛋白(osterix)等表达增加,进而促进下游表达一系列骨相关蛋白,如骨形态发生蛋白-2(BMP2)、骨钙素(osteocalcin)、硬化素(sclerostin)等。血管平滑肌向成骨样细胞主动分化,介导了骨基质在血管中的沉积。因此,抑制钙化过程中VSMC的成骨样细胞表型转换是防治血管钙化的重要途径。补体C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白9(C1q/TNF-Related Protein 9,CTRP9)是近年新发现的CTRP家族成员。CTRP9与脂联素同源且结构类似,最初在脂肪组织中被发现,后被证明其在包括VSMC的多种细胞内均可表达。最近的研究表明,CTRP9最主要来源于心脏并参与调控多种心血管疾病的发生发展。CTRP9可以通过调节内皮细胞舒张血管,抑制VSMC的增殖与迁移,抑制血管炎症等。此外,临床研究表明,CTRP9或可作为糖尿病肾血管损伤标志物,血浆CTRP9水平与2型糖尿病患者的血管僵硬程度成正相关。最近研究报道,在肾脏自体移植的患者中,血清CTRP9的水平与主动脉钙化区域积分(ACAI)成负相关,提示CTRP9或可调控血管钙化过程。然而,目前还未有关于CTRP9在血管钙化中的作用机制研究。自噬是指胞浆内细胞器及其他组分被溶酶体消化、再利用的过程。自噬在维持细胞稳态与应激反应中十分关键。高磷血症是CKD的显著特征之一。研究表明,在高磷刺激下,VSMC自噬水平显著提高,而反过来,增强的细胞自噬过程继而可以拮抗高磷诱导的VSMC钙化。自噬过程受到精密调控,哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是自噬的上游抑制因子,参与调控血管钙化过程。当前关于CTRP9与细胞自噬的研究较少,如CTRP9可通过调控自噬影响apoE敲除小鼠早期斑块的进展等,目前还没有关于CTRP9与mTOR/自噬、血管钙化之前关系的基础研究。人参皂苷是中药人参、三七等的主要成分,提纯后根据化学结构可分为二醇式与三醇式人参皂苷。Rb1是二醇式人参皂苷最主要的单体成分,在多种心血管疾病及肾脏损伤中发挥保护作用。文献表明,Wnt/β-catenin途径是成骨与血管钙化过程中的重要信号通路,Wnt通路激活可促进促钙化因子的表达,通过上调碱性磷酸酶的活性等,最终启动并促进血管钙化的发生发展;另一方面,抑制Wnt/β-catenin通路被报道具有保护血管钙化的效应。PPAR-y属于核受体超家族成员,PPAR-γ与Wnt/β-catenin通路的互相拮抗作用在成骨与钙化过程中至为关键。人参皂甙属于甾体皂甙家族,与甾体激素具有相似的结构,研究报道Rb1可通过激动PPAR-γ在内的多种核受体成员调控下游基因。此外,Wnt/β-catenin通路与mTOR/自噬通路交叉对话(crosstalk)在调控血管钙化中扮演重要角色。如阿托伐他汀被报道可抑制β-catenin通路从而诱导自噬水平增加,进而抑制血管钙化。而本研究开始前,还没有关于人参皂苷Rb1对血管钙化作用及机制的基础研究。我们推测,Rb1或可通过激活PPAR-γ抑制Wnt/β-catenin通路,并增强mTOR依赖的细胞自噬,从而保护血管钙化。综上所述,为阐明CTRP9与人参皂苷Rb1在CKD相关血管中膜钙化中的作用及其分子机制,我们收集了相关临床标本,通过腺嘌呤灌胃建立CKD大鼠血管钙化模型,提取并培养大鼠原代VSMC,采用β-磷酸甘油(β-GP)诱导建立细胞钙化模型,并对相关科学问题进行研究。本论文将分为以下2个部分进行研究与论述:第一部分:CTRP9在血管钙化中的作用及机制研究;第二部分:人参皂苷Rb1对血管钙化的作用及其机制研究。第一部分:CTRP9在血管钙化中的作用及机制研究1.研究目的(1)研究并明确CTRP9在血管钙化中的表达情况及作用:明确CTRP9对血管钙化中钙盐沉积及VSMC成骨样表型转换的作用。(2)研究CTRP9对细胞自噬与mTOR通路相关蛋白的调控作用:明确CTRP9与细胞自噬、mTOR的关系,以及CTRP9是否通过mTOR依赖的自噬途径参与调控血管钙化。(3)研究CTRP9对mTOR调控的直接分子作用机制:明确CTRP9与mTOR之间是否存在直接作用。如存在,两者之间的调控是否通过DNA,mRNA,蛋白水平之间直接结合介导。2.研究方法(1)临床标本收集:于山东大学齐鲁医院就诊,并诊断为慢性肾脏病(CKD G5期),拟行肾脏移植的患者(n=3)及供者(n=3)。收集术中废弃髂/肾动脉血管组织标本。(2)建立CKD-血管钙化大鼠模型:慢病毒尾静脉注射2周后,采用腺嘌呤灌胃8周建立CKD-血管钙化大鼠模型;对照组大鼠予以生理盐水。(3)大鼠原代VSMC的提取和培养:采取“贴壁法”提取:无菌解剖并分离大鼠的胸主动脉段,剥离血管外膜并刮除内膜。将血管中膜组织块均匀贴于培养瓶底壁,并加入完全培养基。约5-7天后,VSMC从组织块边缘迁移出来。(4)验证并建立VSMC钙化模型:使用α-SMA免疫荧光染色验证为VSMC后,第3-8代VSMC应用于体外试验。采用10mM β-GP诱导3-12天,建立VSMC钙化模型。(5)心率、血压监测:实验末,使用无创鼠尾血压计测量大鼠血压与心率,记录各组大鼠收缩压、舒张压、脉压与心率,连续测定3次,取平均值。(6)大鼠心功能监测:实验末,使用小动物超声心动仪,分别在舒张期(d)及收缩期(s),进行测量并计算以下参数:室间隔厚度(IVS)、左心室内径(LVID)、左心室后壁厚度(LVPW)、左心室容积(LVvol)等。取连续5个心动周期的测定平均值进行统计。(7)血清生化检测:实验末,戊巴比妥安乐死大鼠,收集大鼠血清。检测血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、碱性磷酸酶(ALP)、钙(Ca)、磷(P)等生化参数。(8)评估血管/VSMC钙化情况:茜素红S染色、von-Kossa染色评估血管钙化情况、VSMC钙结节诱导形成情况。(9)试剂盒检测血管组织/VSMC细胞匀浆的钙离子浓度。(10)检测血管组织VSMC表型转换:选取收缩表型标志物:α-SMA、Calponin、SM22α;成骨表型标志物:RUNX2、BMP2。免疫组织化学染色、免疫荧光染色检测其在血管壁/细胞内的定位及表达情况;western blot检测标志物的蛋白质水平的表达情况。(11)检测CTRP9的表达水平:ELISA检测血清中循环CTRP9的水平;免疫组化染色检测CTRP9在血管壁的定位情况及表达水平;western blot检测CTRP9的蛋白质水平的表达情况。(12)透射电镜检测VSMC自噬水平:自噬小体、自噬溶酶体的数目。(13)检测mTOR/自噬通路相关蛋白的表达水平:选取通路相关蛋白:mTOR,S6K,ATG5,p62,LC3。免疫组化染色、免疫荧光染色检测mTOR、LC3在血管壁/VSMC的定位及表达情况、LC3荧光斑点的数目;RT-qPCR、western blot检测相关蛋白的mRNA、蛋白质水平的表达情况。(14)检测蛋白-蛋白直接结合:采用免疫荧光双染色结合激光共聚焦显微镜观察分子的亚细胞共定位;免疫共沉淀法(Co-IP)。(15)液相串联质谱(LC-MS/MS):使用目的蛋白抗体,免疫共沉淀后进行电泳。当电泳过程中蛋白质即将分离时,进行考马斯亮蓝染色。切取阳性凝胶条带,酶解、除盐后,用LC-MS/MS鉴定并搜库分析数据。(16)RNA免疫共沉淀(RIP):使用目的抗体将目的蛋白-结合的RNA复合物沉淀后,解离去除蛋白后,RT-qPCR扩增所得RNA,将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。(17)统计分析数据。3.研究结果(1)CKD患者与大鼠的血管发生显著中膜钙化,心肌组织及血管组织内CTRP9表达上调;CKD大鼠血清循环水平的CTRP9没有明显变化。(2)过表达CTRP9促进了 VSMC钙结节形成、细胞匀浆钙离子浓度、VSMC成骨样表型转换;而基因沉默CTRP9则抑制了上述VSMC钙化指标;体内沉默CTRP9减轻了 CKD大鼠血清ALP水平、心率、收缩压、脉压、室间隔厚度、左室容积、左室内径等指标,同时减轻了血管钙化与表型转换。(3)钙化过程中,VSMC与大鼠血管自噬增强;基因沉默CTRP9进一步增强了自噬;3-MA抑制自噬后,沉默CTRP9对表型转换的保护作用逆转。(4)钙化过程中,mTOR的表达上调;过表达CTRP9上调、而沉默CTRP9下调了 mTOR及其底物S6K的mRNA及蛋白质的表达;mTOR激动剂(亮氨酸)可以抑制CTRP9沉默的促进自噬的效应。(5)基因沉默mTOR或使用mTOR抑制剂(雷帕霉素),可以抑制CTRP9过表达的促进钙结节形成与成骨标志物RUNX2表达的效应;mTOR激动剂(亮氨酸)则能逆转上述CTRP9沉默的钙化保护作用。(6)VSMC内,CTRP9蛋白不能与mTOR蛋白直接结合。(7)大鼠VSMC中,与阴性对照交叉对比后,Co-IP结合LC-MS/MS鉴定到了 99种与CTRP9蛋白直接结合的蛋白质。以蛋白丰度进行排序后,前十蛋白主要为核内不均一核糖核蛋白家族(hnRNP)成员,hnRNP A2/Bl为第三位。(8)HnRNP A2/B1蛋白可以与CTRP9蛋白直接结合;hnRNP A2/B1蛋白可以与mTOR mRNA直接结合。(9)过表达hnRNP A2/B1后,CTRP9沉默对mTOR及S6K mRNA的抑制作用得到逆转。4.研究结论(1)VSMC中CTRP9在CKD-血管钙化中表达上调;(2)CTRP9促进血管中膜钙化,沉默CTRP9可以抑制血管钙化;(3)CTRP9通过mTOR依赖的自噬通路发挥对血管钙化的调控作用;(4)hnRNP A2/B1直接结合CTRP9蛋白,并与mTOR mRNA直接结合,这介导了 CTRP9对mTOR通路的调控作用。第二部分:人参皂苷Rb1对血管钙化的作用及其机制研究1.研究目的(1)研究并明确Rb1在血管钙化中的作用:明确Rb1对血管钙化中钙盐沉积、碱性磷酸酶(ALP)活性及VSMC成骨样表型转换的作用。(2)研究并明确Rb1对PPAR-γ与Wnt/β-catenin通路的调控作用:明确Rb1与 PPAR-γ、Wnt/β-catenin 通路的关系;Rb1 是否通过 PPAR-γ抑制 Wnt/β-catenin通路,从而抑制血管钙化;PPAR-γ与Wnt/β-catenin通路上下游调控关系。(3)探索Rb1对mTOR/自噬通路的作用:讨论Rb1是否可通过通路对话,对mTOR/自噬通路发挥调控作用。2.研究方法(1)建立CKD-血管钙化大鼠模型:采用腺嘌呤灌胃6周建立CKD-血管钙化大鼠模型;对照组大鼠予以生理盐水;腹腔注射Rb1 40 mg/kg/d或生理盐水。(2)大鼠原代VSMC的提取和培养:同前述。(3)验证并建立VSMC钙化模型:同前述。(4)血清生化检测:同前述。(5)评估血管/VSMC钙化情况:同前述。(6)试剂盒检测血管组织/VSMC细胞匀浆的ALP活性及钙离子浓度。(7)检测血管组织VSMC表型转换:选取收缩表型标志物:α-SMA、Calponin成骨表型标志物:RUNX2。免疫组织化学染色检测其在血管壁/细胞内的定位情况及表达水平;western blot检测标志物的蛋白质水平的表达情况。(8)检测PPAR-γ、Wnt/β-catenin通路相关蛋白的表达水平:选取通路相关蛋白:PPAR--γ,GSK3β,β-catenin。免疫荧光染色结合共聚焦显微镜观察β-catenin胞质、胞核转位及PPAR-γ表达情况;胞质、胞核分离提取蛋白后,western blot检测β-catenin核转位情况;western blot检测其他相关蛋白的蛋白质水平的表达情况。(9)统计分析数据。3.研究结果(1)腹腔注射Rb1降低了 CKD大鼠血清无机磷的水平,显著减轻了 CKD大鼠的血管钙化、血管组织的ALP活性与钙离子浓度;体外实验中,40 mM的Rb1减轻了 VSMC钙结节的形成与细胞匀浆钙离子浓度。(2)腹腔注射Rb1显著减少了 CKD大鼠钙化血管中成骨标志物RUNX2的表达,增加了收缩标志物α-SMA、Calponin的表达;体外实验中,Rb1增加了VSMC诱导钙化过程中α-SMA、Calponin的表达,减少了 RUNX2的表达,且其作用成浓度依赖性方式。(3)血管钙化过程中,Wnt/β-catenin通路激活,β-catenin向胞核内转位增加,PPAR-γ减少;Rb1上调了 CKD大鼠血管与VSMC中PPAR-γ的表达,抑制β-catenin的表达;Rb1抑制了 VSMC中β-catenin的胞核转位。(4)采用Wnt/β-catenin通路激动剂SKL2001处理后,Rb1对VSMC钙盐沉积与表型转换的保护作用逆转。(5)使用PPAR-γ的抑制剂GW9662后,Rb1对β-catenin的抑制作用逆转。4.研究结论(1)Rb1具有抑制CKD相关血管中膜钙化的作用;(2)Rb1通过激动PPAR-γ、抑制Wnt/β-catenin通路,从而发挥对血管钙化的调控作用。