雷公藤内酯醇(Triptolide)是从卫矛科雷公藤属植物雷公藤中分离到的二萜内酯化合物。分子式C20H24O6。研究表明,其在体外具有明确的抗白血病活性。福建省血研所于1983-1990年曾对该药物进行了I期及II期的临床研究,根据对45例急性白血病的治疗观察,完全缓解率达47.6%。尤其对急性粒细胞白血病疗效更好,完全缓解率高达75.0%。对其抗癌机制的研究表明,该药物可引起白血病细胞株DAMI、HL60、K562产生明显的凋亡现象。因此,雷公藤内酯醇是非常有前景的抗白血病新药。 雷公藤内酯醇药理活性较强,但也有一定毒性。在安全有效的剂量范围内,该药物的主要副作用是部分病人用药后发生静脉炎。动物实验表明,以40μg/kg/日对犬连续7天静脉给药,可出现心脏、造血和胃肠道毒性反应。 雷公藤内酯醇的毒副作用呈剂量相关性。我们认为,寻求与其具有协同或相加作用的抗癌药物联合应用,可降低雷公藤内酯醇使用剂量而减轻其毒副作用。本课题采用6种白血病细胞株(K562、K562/ADM、HL60、U937、CA46、MOLT-4)检测雷公藤内酯醇和阿霉素、高三尖杉酯碱、阿糖胞苷、长春新碱、羟基脲联合应用的抗癌活性。结果表明,雷公藤内酯醇与临床常用抗癌药联合应用,具有单纯相加甚至加强的协同杀伤效果,尤以和阿霉素、高三尖杉酯碱及阿糖胞苷联合应用时更为显著。本课题对雷公藤内酯醇的半数致死量进行了测定并对荷瘤裸鼠实施了联合<WP=4>用药治疗。应用昆明小鼠,以bliss法计算半数死亡剂量(LD50)及其95%可信限为1.03(0.87-1.13) mg/kg。抗裸鼠移植瘤实验表明,联合应用雷公藤内酯醇和阿霉素,较低的用药剂量即能达到较高单一用药剂量的治疗效果。单用高剂量的雷公藤内酯醇(30μg/kg),可出现脏器损害,尤以肝脏受损为著。低剂量(5μg/kg)雷公藤内酯醇与1mg/kg阿霉素联合用药时,对脏器的损害轻微,未见明显的病理改变,而疗效不亚于高剂量单独用药。研究结果证实,雷公藤内酯醇和阿霉素具有协同抗白血病细胞增殖的作用。联合用药具有减低毒性,提高疗效的优点。目前对白血病的治疗以联合化疗为主。通过联合化疗大多数患者可以获得完全缓解,但是最终多数容易产生耐药。多药耐药(Multidrug resistance ,MDR ),即对多种化学结构和作用机理完全不同的化疗药物同时产生耐药,已经成为治愈白血病的主要障碍之一。耐药研究具有重要意义。K562/ADM为阿霉素诱导建立的MDR细胞株,对阿霉素、高三尖杉酯碱、长春新碱以及羟基脲存在不同程度的耐药性。本研究表明,该细胞经过20ng/ml的雷公藤内酯醇处理24小时,耐药现象得到逆转。与K562相比,K562/ADM细胞P-糖蛋白(P-gp)和抗人多药耐药相关蛋白(Multidrug Resistance Associated Protein, MRP)表达增高,可能是该细胞产生MDR的原因之一。K562/ADM细胞经雷公藤内酯醇作用24小时后,P-gp和 MRP的表达均明显下降,提示雷公藤内酯醇逆转K562/ADM耐药与抑制膜转运蛋白有关。本课题对雷公藤内酯醇的抗白血病机制进行了研究。HL60细胞经雷公藤内酯醇作用24小时,其Bcl-2和突变型P53蛋白表达均显著下降,mRNA水平也发生相应改变,同时Caspase-3和Bax蛋白表达升高,提示雷公藤内酯醇抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡,可能通过下调其bcl-2和突变型p53 mRNA表达及<WP=5>阻断形成相应蛋白产物并激活Caspase-3而发挥作用。对信号转导的研究发现,经雷公藤内酯醇处理24小时,HL60细胞MEK-1和c-Jun蛋白表达明显减少,并呈量效关系。提示雷公藤内酯醇可通过下调 Ras/Raf/MEK/Erk途径的信号转导,最终减少核转录因子c-Jun的含量而抑制细胞的增殖。RNAi(RNA interference,RNAi,RNA干扰)是高度特异的在mRNA水平上的基因沉默机制,由内源性或外源性双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)诱发。dsRNA在细胞内被切割成21-25nt干扰性小RNA(small interfering RNA,siRNA),siRNA介导识别并靶向切割同源性靶mRNA分子,从而导致该基因不表达。2001年,Tuschlt研究组应用21nt siRNA 在哺乳动物细胞中诱导了强有力的特异性RNA干扰作用,开创了RNAi技术治疗人类疾病的新途径。RNAi 成了继反义基因治疗之后,肿瘤基因治疗研究的一个新热点。Bcl-2是调节细胞凋亡的重要基因,其过度表达可抑制多种因素诱导的细胞凋亡。HL60细胞bcl-2高表达。本研究利用针对bcl-2基因的siRNA,作用于HL60细胞,发现bcl-2 siRNA能明显抑制HL60细胞增殖。荧光定量RT-PCR检测显示,经bcl-2 siRNA处理36小时后的HL60细胞,其mRNA表达明显减低,Western Blot 检测提示Bcl-2蛋白减少。流式细胞仪和电镜检查证实,bcl-2 siRNA能诱导HL60细胞凋亡。bcl-2 siRNA 还能显著增加HL60细胞对雷公藤内酯醇的敏感性,因此,两者联合应用,有助于减低雷公藤内酯醇的使用剂量并提高其抗白血病活性,为白血病的联合用药提供了新的思路。综上所述,雷公藤内酯醇和多种抗癌药物具有协同作用,并能逆转白血病细胞的耐药性。其抗癌机制可能是通过抑制癌细胞bcl-2和突变型p53 mRNA<WP=6>的表达及阻断形成相应蛋白产物并激活Caspase-3而发挥作用。雷公藤内酯醇还可通过下调 Ras/Raf/MEK/Erk途径的信号传导,最终减少核转录因子c-Jun的含量而抑制细胞的增殖。针对bcl-2基因的siRNA,能明显抑制HL60细