肝脏是畜禽体内最大的消化腺,最大的代谢和解毒器官,同时还在胆汁生成和排泄、凝血、免疫、热量产生及水与电解质的调节中均起着非常重要的作用,可以说肝脏是机体的一个巨大的“化学工厂”。畜禽饲料的霉变、抗生素的滥用、矿物质的超剂量使用、蛋白质的过量添加、微生物的严重感染等,给肝脏带来很大的负担,使肝脏活动被抑制或被损害,肝脏处于中毒状态。长时间的毒素蓄积可诱发肝细胞变性、坏死以及炎性肿胀、纤维组织增生等肝脏病变,继而出现肝脏肿瘤。咖啡酸苯乙酯(CAPE)是蜂胶中的主要活性成分之一,为黄酮类化合物,拥有邻二酚羟基的活性基团,具有很强的抗肿瘤、抗氧化、抗炎、免疫调节等多种药理活性,特别是其抗肺瘤作用引起了人们的广泛关注,其通过影响细胞的氧化还原状态、调节细胞凋亡相关因子的表达、抑制肿瘤细胞的增殖、抑制核转录因子NF-KB的增殖等多种机制起到抗肿瘤的作用。咖啡酸对硝基苯乙酯(CAPE-NO2)由西南大学药学院药理教研室根据CAPE的结构特点,自行设计合成的新化合物,前期经过代谢、免疫、心血管等多项生物活性试验分析,有强于咖啡酸苯乙酯的活性。肝癌HepG-2细胞,常被用于体内外肝细胞代谢或遗传毒性试验方面的理想细胞系;常作为工具细胞,来筛选具有高活性的抗肝脏肿瘤化合物。本文在优化CAPE-NO2合成的基础上,通过体内外研究该化合物抗肝脏肿瘤的效果。一、CAPE-NO2的合成及结构表征通过咖啡酸和4-硝基苯乙基溴,在少许EDCI、DMAP条件下,“一锅法”合成咖啡酸对硝基苯乙酯(CAPE-NO2)。通过熔点测定、红外光谱、核磁共振分析,确证所得化合物与提供的标准化合物的结构一致。本合成工艺简单,条件温和,产率达到92%,适合于工业化生产研究。二、CAPE-N02对肝癌HepG-2细胞株裸鼠增殖瘤的抑制作用用肝癌HepG-2细胞株建立BALB/C裸鼠移植瘤模型,观察了对肿瘤的抑制效果,检测了小鼠胸腺和脾脏指数、腹腔巨噬细胞吞噬作用、脾脏T淋巴细胞增殖反应、NK细胞活性、血清 NO 及 IL-1、TNF-α 含量。结果表明,①CAPE-NO2(3mg/kg、6mg/kg、12mg/kg)荷瘤小鼠的肿瘤抑制率分别达到50.67%、55.58%、71.31%,明显高于CAPE(3mg/kg、6mg/kg、12mg/kg)的 38.84%、41.38%、48.89%;CAPE-NO2(3mg/kg、6mg/kg、12mg/kg)相对肿瘤增殖率分别达到47.03%、36.27%、21.18%,明显低于CAPE(3mg/kg、6mg/kg、12mg/kg)的 60.90%、46.16%、30.11%;表明,CAPE-NO2对肝癌 HepG-2 细胞株裸鼠移植瘤有很好的抑制作用。②与CAPE相比较,CAPE-NO2使荷瘤小鼠的胸腺和脾脏指数明显升高(P<0.01),说明,CAPE-NO2对胸腺和脾脏有一定的保护作用,这种保护作用与疏水性参数ClogP的减小而增强。③与模型组相比,CAPE-NO2对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红的促进作用明显(P<0.01),吞噬作用呈剂量依赖关系,浓度越低,促吞噬作用越强。④与模型组相比,CAPE-NO2可显著降低荷瘤小鼠升高的NO水平(P<0.01),并呈一定的剂量依赖关系,说明CAPE-NO2可能通过减少NO的量而发挥抗肿瘤作用。⑤与模型组相比,CAPE-NO2对荷瘤小鼠NK细胞杀伤活性显著提高(P<0.01),呈一定的剂量依赖关系。⑥与模型组相比,CAPE-NO2使Con A诱导的荷瘤裸小鼠脾脏T淋巴细胞增殖反应明显增强(P<0.01),随着剂量增加增殖活性增强,恢复至接近正常水平,说明CAPE-NO2可提高荷瘤小鼠T细胞的应答能力。⑦与模型组相比,CAPE组、CAPE-NO2组可以使荷瘤小鼠体内低下的IL-1分泌水平有显著提高(P<0.01)和显著抑制TNF-αa的水平(P<0.01),呈一定剂量依赖关系,而12mg/kgCAPE-NO2组恢复至接近正常水平。结论,CAPE-NO2对肝脏HepCG-2细胞株荷瘤小鼠移植瘤有很好的抑制作用;与其能提高荷瘤小鼠的免疫功能密切相关。三、CAPE-N02对肝癌HepG-2细胞凋亡的影响通过研究CAPE-NO2对肝癌HepG-2细胞凋亡的影响,以探讨其可能的抑制肝脏肿瘤的机制,观察对肿瘤细胞的增殖抑制率.检测了凋亡细胞的形态学变化、细胞凋亡率、细胞周期分布、凋亡相关蛋白表达和凋亡信号通路相关蛋白的表达。结果表明,①与CAPE相比,CAPE-NO2对HepG-2细胞增殖有显著的抑制作用(P<0.01),随着浓度的增加抑制率升高,并且CAPE-NO2对肝脏肿瘤HepG-2细胞的IC50显著降低(14.36±1.36)(P<0.01),说明CAPE-N02对HepG-2细胞增殖有很强的抑制作用。②通过AO染色,在荧光显微镜下观察CAPE-NC2处理肝癌HepG-2细胞后,细胞呈现染色增强,荧光更亮,细胞核固缩,有的细胞核碎裂形成多个球形颗粒,为凋亡或者坏死的细胞;与CAPE相比,在荧光显微镜对每组多个视野的细胞进行计数统计,CAPE-NO2对HepG-2细胞凋亡效果明显,细胞凋亡率随着浓度的增加而显著增加(P<0.01),呈现浓度依赖性,说明CAPE-NO2能很好的诱导HepG-2细胞的凋亡。③浓度为5μM、10μM、20μM的CAPE-NO2的细胞凋亡率分别为18.03%、20.66%、20.47%,显著高于对照组(P<0.01);与CAPE相比,相同浓度的CAPE-N02对HepG-2细胞凋亡率显著提高(P<0.01),说明CAPE-NC2能够诱导HepG-2细孢凋亡。④与CAPE相比,C’APE--NO2对肝癌FepGG-2细胞的周期分布发生了明显的变化(P<0.01),Go/G1期的肝癌细胞减少,但G2/M期的肝癌细胞却增多,对S期细胞无明显变化(P>0.01);CAPE-NO2处理后将肝癌细胞周期阻滞于G2/M期,并且随着浓度的增加G2/M期细胞增加的越多(P<0.01),呈剂量依赖性。⑤与CAPE相比,CAPE-NC2作用于HepG-2细胞后,可显著增强caspase-3蛋白的裂解、上调细胞Bax和下调Bcl-2蛋白表达(P<0.01),呈剂量依赖性。⑥与CAPE相比,CAPE-NO2可以显著下调PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白表达水平(P<0.01),且PI3K/p-PI3K、p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR的比例呈下降趋势,呈剂量依赖性。表明CAPE-NO2诱导肝癌细胞凋亡可能与抑制Akt的磷酸化有关。四、CAPE-NO2与抗肝癌HepG-2构效关系研究用Chemoffice 8.0分析CAPE-NO2的结构参数与抗肝癌HepG-2细胞的IC50之间的构效关系研究。结果发现,与CAPE相比,CAPE-N02抗肝癌HepG-2细胞活性随着ClogP减小、分子总能量和能量差(AE)降低而增强,随着偶极矩的增加而增强,并且与电荷的变化也有一定的关系。结论,咖啡酸对硝基苯乙酯(CAPE-NO2)是在CAPE的苯环上引进吸电子基团硝基(-NO2)得到的化合物,该化合物有良好的抗肝脏肿瘤效果,可能与增强机体免疫功能和诱导细胞凋亡有关。