前列腺癌(Prostate cancer, PCa)是常见的男性生殖系统恶性肿瘤。目前为止,雄激素剥夺疗法仍是治疗进展期PCa的首选方案,虽然起初该治疗手段会取得一定效果,但临床实践证明在接受该治疗12-18个月后,几乎所有的患者都会转为去势抵抗性前列腺癌(Castration resistant prostate cancer, CRPC),死亡率极高。在CRPC的转变过程中,雄激素受体介导的信号通路会发生多种改变,其中既包括受体依赖性(AR突变／扩增,肿瘤组织产生雄激素,共调解分子以及AR靶基因的变化),又可以是AR非依赖性的。抑制雄激素合成(比如阿比特龙)和拮抗AR活性(如MDV3100)等药物的出现在治疗CRPC方面取得了很大的进展,但非常遗憾的是,在经过一段时间的治疗后,上述药物在体内都会很快引起耐药性的出现。因此,CRPC研究的主要目标是：寻找引起CRPC产生的关键基因及信号分子,以这些关键基因及信号分子为靶点,通过阻断或抑制前列腺癌细胞中与增殖相关的致病途径,使细胞不再向去势抵抗性(雄激素非依赖性)生长的方向转化,而该目标的实现会为治疗CRPC带来非常大的突破。硫氧还原蛋白是一类在体内广泛表达的蛋白,可参与调控氧化还原反应。研究表明,与相应的正常组织或良性增生组织相比,该家族的很多成员都在恶性肿瘤组织中过表达,并与肿瘤的增殖以及患者的预后相关。针对该家族成员的抑制剂,比如PX-12和SAHA,都已用于实验动物模型或临床初试。硫氧还原蛋白5(Thioredoxin domain-containing protein 5, TXNDC5)属于其家族一员,具有蛋白折叠和分子伴侣活性。研究发现TXNDC5在多种恶性肿瘤中都有过表达。有研究提示TXNDC5在长期雄激素剥夺的LNCaP细胞中表达明显升高,但它在CRPC发生和发展中的作用和机制有待于进一步研究。研究目的：1、分析TXNDC5在CRPC转变过程中的作用；2、研究TXNDC5促进PCa进展的致病机制；3、探讨TXNDC5在前列腺癌中的表达调控机制。创新点及意义：1、本研究首次证明TXNDC5可促进CRPC的转变,并阐明其作用的发挥依赖于AR信号通路；2、分析了雄激素剥夺治疗后诱导的乏氧在促发CRPC转变时,TXNDC5可能起到关键分子的作用,并明确了miR-200b所介导的乏氧对TXNDC5表达的调控；3、本研究发现了诱导CRPC转变的关键分子,提示可以研发针对TXNDC5的抑制剂,用于CRPC的治疗和预防。研究方法：1、探讨TXNDC5在PCa中的表达特点1.1免疫组织化学法检测TXNDC5在PCa组织中的表达收集71例局限性激素敏感性PCa组织和23例CRPC组织,免疫组织化学法检测其表达。1.2体外诱导PCa细胞发生雄激素非依赖性生长转变,检测’TXNDC5的表达变化雄激素剥夺条件培养雄激素敏感性PCa细胞(LNCaP), Western blot法检测TXNDC5的表达变化。2、研究TXNDC5在PCa细胞中的生物学功能2.1 Western blot检测针对TXNDC5的小干扰RNA (siRNA)的抑制效率和过表达质粒的表达效率2.2调控TXNDC5表达后对PCa细胞增殖、侵袭和周期的影响沉默TXNDC5的表达,采用MTT、Transwell和流式细胞术等方法检测对细胞增殖、侵袭和细胞周期的影响；将TXNDC5过表达载体转染入LNCaP细胞后,G418筛选过表达的稳转细胞系(LNCaP-TXNDC5),采用以上方法检测其对细胞活性的影响。2.3 TXNDC5对成瘤性的影响分别将LNCaP-TXNDC5和其对照(LNCaP-VC)注入裸鼠腋下,观察不同时间点对成瘤性的影响。2.4 TXNDC5对前列腺特异性抗原(Prostate specific antigen, PSA)分泌的影响3、研究TXNDC5在CRPC转变过程中的作用3.1在雄激素剥夺条件下,体内外实验检测调控TXNDC5的表达对细胞增殖和成瘤性的影响在雄激素剥夺条件下,MTT法检测过表达TXNDC5对PCa细胞增殖的影响；将LNCaP-TXNDC5和LNCaP-VC分别接种于裸鼠腋下,对裸鼠行去势处理,观察对成瘤性的影响。3.2 TXNDC5对CRPC相关信号通路活性的影响在LNCaP-TXNDC5和LNCaP-VC细胞中,加入双氢睾酮(DHT)和CoCl2的刺激,Western blot法检测过表达TXNDC5对LNCaP细胞中Akt、MAPK、Her2和MET等信号通路总蛋白和磷酸化蛋白表达水平的影响。4、鉴定与TXNDC5相互作用的蛋白构建含HA标签的TXNDC5表达载体,转染入LNCaP细胞,免疫沉淀法提取细胞中的TXNDC5蛋白及其相互结合蛋白。将样品进行SDS-PAGE跑胶,取表达差异的胶粒进行质谱鉴定。5、研究TXNDC5功能的发挥与AR信号通路的关系5.1 TXNDC5调控细胞增殖和侵袭的功能是否依赖于AR信号通路沉默PCa细胞中AR的表达或用Enzalutamide抑制AR的活性,MTT和Transwell法检测以上处理对LNCaP-TXNDC5细胞增殖和侵袭的影响。5.2 TXNDC5促进癌细胞在裸鼠体内成瘤的功能是否依赖于AR信号通路将LNCaP-TXNDC5和LNCaP-VC细胞注入裸鼠腋下,等到瘤块体积增长至200mm3时对其进行去势处理；当血清中的PSA水平超过50ng/mL时,将Enzalutamide和对照注射入小鼠体内,观察对小鼠成瘤性的影响。6、研究TXNDC5对AR信号通路的调控6.1 TXNDC5对AR表达的调控调控TXNDC5在PCa细胞中的表达,Western blot法检测对AR表达的影响；放线菌酮处理LNCaP-TXNDC5, Western blot法检测对AR蛋白稳定性的影响；免疫共沉淀法检测沉默TXNDC5表达对AR与HSP-90结合量的影响。6.2 TXNDC5对AR入核的影响在LNCaP细胞中过表达TXNDC5,同时给予DHT刺激,Western blot法检测AR在细胞胞浆和胞核中的表达。6.3 TXNDC5对AR活性的影响1) TXNDC5对PSA转录活性和表达的调控将AR表达载体和PSA启动子报告基因载体转染入HEK293T,报告基因法检测在有无DHT刺激时PSA启动子区的转录活性；同时调控上述细胞中TXNDC5的表达,相同方法检测TXNDC5是否影响PSA的启动子活性；在LNCaP-VC和LNCaP-TXNDC5中,加入不同浓度的DHT, real-time PCR法检测对PSA表达量的影响。2) TXNDC5对AR活性的影响在LNCaP-VC和LNCaP-TXNDC5中转染入PSA启动子报告基因载体,加入不同浓度的刺激因子(包括雌激素、氟他胺和Enzalutamide),检测对PSA转录活性的影响；在LNCaP-VC和LNCaP-TXNDC5中,加入DHT刺激,real-time PCR法检测AR靶基因(TMPRSS2、FKP51、KLK2和S100P)的表达情况。3) TXNDC5对Enzalutamide药效的影响在LNCaP-VC和LNCaP-TXNDC5中转染入PSA启动子报告基因载体,同时加入不同浓度Enzalutamide,检测对PSA转录活性的影响。7、研究HSP70对TXNDC5表达和功能的影响7.1 HSP70对TXNDC5功能的影响沉默LNCaP-TXNDC5细胞中HSP70的表达或用KNK474抑制剂干扰其活性后,MTT和Transwell法检测以上处理对细胞增殖和侵袭能力的影响。7.2 HSP70对TXNDC5表达的调控沉默PCa细胞中HSP70的表达或用KNK474抑制剂干扰其活性后,Western blot法检测对TXNDC5蛋白表达的影响；干扰PCa细胞中HSP70的表达,同时在细胞中加入放线菌酮,Western blot法检测对TXNDC5蛋白稳定性的影响。8、探讨在PCa病变过程中,乏氧对TXNDC5表达和功能的调控8.1 CoCl2诱导的乏氧对TXNDC5表达和活性的影响1)用CoCl2处理PCa细胞,Western blot法检测TXNDC5的表达变化。2)免疫共沉淀法检测长期雄激素剥夺以及CoCl2处理对TXNDC5与AR结合量的影响。8.2乏氧是否通过microRNA调控TXNDC5的表达1)沉默HIF-1α表达后检测TXNDC5的表达；ChIP和报告基因法检测HIF-1α是否通过结合在TXNDC5的启动子区或影响其转录活性来调控其表达。2) Real-time PCR法检测乏氧刺激后,miR-200b在LNCaP, LNCaP-AI和PC3细胞中的表达水平。3)将miR-200b mimic或inhibitor,以及阴性对照转染入PCa细胞中,Western blot法检测TXNDC5的表达变化。4)在VCaP和PC3细胞中转染miR-200b mimic和阴性对照,同时给予细胞CoCl2刺激,Western blot法检测TXNDC5蛋白的表达变化。5)构建针刘miR-200b靶向TXNDC5 mRNA 3’UTR的荧光素酶报告基因,并同时对miR-200b的结合位点进行突变,将miR-200b mimic/inhibitor和报告基因转染入HEK293T细胞中,检钡miR-200b对TXNDC5 mRNA 3’ UTR活性的影响。结果：1、TXNDC5的表达在CRPC转变过程中明显上调1.1 TXNDC5主要表达于PCa细胞胞浆；在所检测的71例局限性激素依赖性PCa中,有65.5%的病例显示阴性或弱阳性,而只有35.5%显示中等或强阳性；在CRPC组织中,69.6%的病例呈中等或强阳性,而30.4%是阴性或弱阳性。也就是说,TXNDC5在CRPC组织中高表达的频度明显高于局限性激素依赖性PCa(Pearson’s=0.672, P=0.017)。1.2长期雄激素剥夺诱导LNCaP发生雄激素非依赖性生长转变后,TXNDC5在mRNA和蛋白水平上的表达量均明显升高。2、2TXNDC5与PCa细胞的异常增殖和侵袭相关2.1通过Western blot法检测,选择了2条干扰效率较高的siRNA用于后续实验；转染表达质粒进入LNCaP细胞后,TXNDC5的表达量明显升高。2.2体外实验证明,沉默VCaP, LNCaP, DU145和PC3中TXNDC5的表达后,可显著抑制细胞的增殖和侵袭能力,并可将细胞周期阻滞在S期；而在LNCaP细胞中过表达TXNDC5后,PCa细胞的增殖和侵袭能力均明显升高。2.3体内实验证明,将LNCaP-TXNDC5到裸鼠腋下后,细胞的成瘤能力(LNCaP-TXNDC5组瘤块大小：2250 mm3)明显高于对照组(LNCaP-VC组瘤块大小：816 mm3)。2.4通过检测裸鼠血清和细胞培养上清中PSA的表达水平发现,上调或抑制TXNDC5的表达后,PSA的分泌也出现相同趋势的变化。3、TXNDC5可促进CRPC的发生和进展3.1雄激素剥夺条件下,在LNCaP细胞中过表达TXNDC5可显著促进细胞的增殖速率；而在裸鼠去势条件下,从接种肿瘤细胞的第二周起,NCaP-TXNDC5组的瘤块明显大于接种LNCaP-VC的对照组。3.2 LNCaP-TXNDC5细胞一旦接受DHT刺激,Her-2、ERK1/2和Akt信号通路的磷酸化水平都明显上调,并且升高的幅度显著高于LNCaP-VC细胞组；而在接受CoCl2刺激时,MET、ERK1/2和Akt信号通路的活性在TXNDC5过表达的细胞中也明显增高,且被激活的程度明显高于对照组。4、TXNDC5可与AR和HSP70相互结合在LNCaP细胞中过表达含有标签蛋白的TXNDC5,免疫共沉淀和质谱技术检测PCa细胞中与TXNDC5相互结合的蛋白,发现AR和HSP70蛋白可分别与TXNDC5结合；免疫共沉淀实验也证实了内源性TXNDC5可分别与AR和HSP70蛋白相互结合。5、TXNDC5通过AR信号通路发挥作用5.1沉默AR的表达或抑制AR活性后,可显著抑制’TXNDC5促PCa细胞增殖和侵袭的能力。5.2在小鼠体内注射Enzalutamide后,接种LNCaP-TXNDC5细胞的成瘤速度为19.6 mm3/周,而LNCaP-VC组为168.1 mm3/周。6、TXNDC5可活化AR信号通路6.1 TXNDC5可促进AR的蛋白稳定性和入核调控TXNDC5的表达后,对AR在mRNA上的表达水平无明显影响；而沉默或过表达TXNDC5后,会显著抑制或上调AR在蛋白水平上的表达量；放线菌酮蛋白酶抑制分析法发现,过表达TXNDC5后,会明显增加AR的蛋白稳定性；免疫共沉淀实验证明,抑制TXNDC5表达后,会减少AR与HSP-90的结合量。Western blot检测发现,DHT刺激LNCaP-VC细胞可上调AR在胞核中的表达量(核／质比)；但过表达TXNDC5后,AR蛋白表达的核／质比升高更为明显。6.2 TXNDC5可活化AR信号通路1) TXNDC5促进PSA的转录活性和表达通过报告基因检测发现,TXNDC5过表达可显著上调雄激素对PSA启动子区转录活性的激活作用；real-time PCR检测结果也证实了以上趋势,即过表达TXNDC5可显著增强雄激素对PSA表达量的上调作用。2) TXNDC5活化AR信号通路与DHT刺激相比,氟他胺和Enzalutamide处理会抑制PSA的转录活性；但TXNDC5过表达后,会在一定程度上逆转它们对PSA转录活性的抑制作用；在高浓度雌激素刺激下,过表达TXNDC5也可上调其对PSA转录活性的激活效应。此外,在过表达TXNDC5的LNCaP细胞中给予雄激素刺激时,可显著上调AR靶基因(TMPRSS2、FKP51、KLK2和S100P)的表达。3) TXNDC5可影响Enzalutamide的药效在DHT刺激下,不同浓度的Enzalutamide刺激虽可抑制PSA的转录活性,但过表达TXNDC5后可在一定程度上逆转Enzalutamide对PSA转录活性的抑制作用。7、HSP70调控TXNDC5的蛋白稳定性7.1在LNCaP-TXNDC5细胞中加入干扰HSP70活性的抑制剂,发现对PCa细胞的增殖和侵袭无明显影响。7.2沉默HSP70的表达或抑制其活性后可抑制TXNDC5的表达；放线菌酮蛋白酶抑制分析法检测发现,沉默HSP70的表达可显著降低TXNDC5蛋白的半衰期。8、miR-200b介导了乏氧对TXNDC5的表达调控8.1乏氧可上调TXNDC5的表达和活性1) CoCl2诱导的乏氧条件可以上调XNDC5的表达。2)乏氧可上调TXNDC5与AR的相互结合量。8.2乏氧通过miR-200b调控TXNDC5的表达1)干扰HIF-1α在PCa细胞中的表达后,TXNDC5在mRNA和蛋白水平上的表达量均降低；但ChIP法检测未发现HIF-1α可结合在TXNDC5的启动子区；报告基因法检测发现过表达HIF-1α和乏氧刺激对其启动子区的活性无明显调控作用。2) Real-time PCR结果显示,miR-200b在LNCaP, LNCaP-Al和PC3细胞中的表达依次降低；而加入CoCl2刺激后,miR-200b的表达显著降低。3)在VCaP和PC3中,转染入 miR-200b mimic后,TXNDC5的蛋白表达明显下调；而在LNCaP和RWPE细胞中转染入miR-200b inhibitor后,TXNDC5的表达明显上调。4)经过软件预测分析,发现miR-200b与TXNDC5的3’-UTR存在相互结合的互补序列,所以我们构建了针对miR-200b结合TXNDC5 3’ -UTR序列的野生型和突变型报告质粒。报告基因检测证实miR-200b可作用于TXNDC5的3’-UTR,从而调控TXNDC5蛋白的表达。5)在PCa细胞中过表达miR-200b后,会显著抑制CoCl2诱导的乏氧对TXNDC5表达的上调作用。结论：1、TXNDC5可通过AR信号通路促进PCa,特别是CRPC的发生和发展；2、TXNDC5可上调AR信号通路的活性；3、乏氧通过miR-200b调控TXNDC5的表达。