背景目的嘌呤信号主要由三部分组成：①细胞外核苷酸,细胞外微环境的重要成分；②核苷酸水解酶(如CD39即ENTPD1,二三磷酸核苷酸水解酶-1),通过将核苷酸水解为核苷来调节细胞应答；③核苷酸及衍生物作用的特异性受体。三磷酸腺苷(ATP)不仅在细胞能量代谢过程中发挥着重要作用。最近有研究发现,细胞外ATP作为一种新的危险信号,通过作用于2型嘌呤受体(P2)激活细胞内的信号级联反应,参与机体内诸多病理生理过程,如细胞增殖,分化,凋亡,炎症反应和代谢等。P2受体可以识别ATP和其他的三磷酸和二磷酸核苷,其家族分为7个离子通道型P2X受体(P2X1-7)和8个G蛋白偶联P2Y受体(P2Y1，2,4,6,11-14)两种类型。不同的P2受体对不同的激动剂具有不同的亲和力和特异性,可据此调节细胞功能。高浓度的细胞外ATP通过多种分子机制发挥其抗肿瘤活性。现已发现ATP不仅能促进抗肿瘤免疫反应,而且对多种肿瘤细胞有直接的细胞毒性。在15种P2受体亚型中,有五种直接参与ATP的肿瘤杀伤作用,分别是P2X5, P2X7, P2Y1, P2Y2, P2Y11。然而这些嘌呤受体介导的肿瘤细胞杀伤的确切分子机制尚不明确。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路处于细胞功能的调控中心,在细胞生长中处于核心地位。在人类肿瘤中,经常发生mTOR信号通路的过度激活或突变。mTOR信号传导通路活化可以抑制细胞凋亡,促进细胞周期进展,促进细胞的增殖,并参与血管生成,参与肿瘤的侵袭和转移。细胞内信号转导通路非常复杂,抑制信号通路中某个成分,常常破坏关键的负反馈机制,以致其他代偿通路被激活。因此,充分认识嘌呤信号的复杂性(包括负反馈调节回路),以及明确ATP-嘌呤受体诱导的细胞毒性信号通路的下游组成,将有助于明确抑制信号调控网络中某特定分子后可能的生物学后果,为肿瘤的治疗寻找新的途径。材料方法1.实验动物与细胞培养2.结肠癌细胞MCA38和黑色素瘤细胞B16／F10体外增殖及活性检测：CCK-8和原位成像流式细胞仪分析3. x CELLigence RTCA MP仪器实时动态监测细胞生长4.克隆形成实验观察MCA38肿瘤细胞克隆形成情况5.拮抗剂或激动剂(嘌呤受体、Ca2+及选择性细胞信号通路)与MCA38和B16／F10肿瘤细胞共培养,检测细胞体外增殖／活性,及分析蛋白表达情况6.蛋白质提取与蛋白印记分析7.提取RNA,进行RT-PCR8.慢病毒P2X7shRNA构建P2X7基因沉默的稳定的MCA38和B16／F10肿瘤细胞株9.溴化乙锭摄取实验观察细胞表面孔洞的形成10.通过高效液相色谱法(HPLC)测定细胞内核苷酸水平的变化11.C57BL／6雄性小鼠肿瘤种植取材12.统计学分析结果1、ATP在体内和体外具有抗肿瘤作用MCA38和B16／F10两种肿瘤细胞经过细胞外高浓度ATP的短时间处理(15-30分钟),细胞的活性和增殖被有效抑制,且呈时间和浓度依赖性。ATP的细胞毒性对肿瘤细胞的生物学功能有多方面的影响：在体外实验中,表现为抑制细胞活性、增殖和克隆形成；在体内实验中,表现为抑制C57BL／6野生型小鼠中种植肿瘤的生长。通过xCELLigence RTCA MP系统实时监测肿瘤细胞生长,发现ATP对肿瘤细胞的细胞毒性是直接并且迅速的,并且这种细胞毒性作用来自于ATP,而非其降解产物ADP或腺苷。即使被极高浓度的ADP或者腺苷(10mM)长时间干预,肿瘤细胞的生长也不受影响。此外,我们还发现胞外高浓度ATP能显著诱导作为自噬敏感标志的LC3-Ⅱ表达,这种表达也呈时间和浓度依赖性。2、ATP对PI3K/AKT, AMPK和mTOR信号调控网络的影响我们首先检测细胞外高浓度ATP对MCA38细胞和B16/F10细胞中mTOR、磷酸肌醇-3-激酶和蛋白激酶B (PI3K/AKT)和AMP激酶(AMPK)信号传导通路的影响。肿瘤细胞经过细胞外高浓度ATP处理后,mTOR和PI3K/AKT信号通路中各分子的磷酸化水平降低,同时伴随AMPK通路分子的活化。这种变化呈时间和浓度依赖性,且与细胞的生长状态(完全培养基或无血清培养基)无关。为进一步明确ATP诱导的mTOR, PI3K/AKT和AMPK信号通路的改变情况,我们选用针对相应信号通路分子的阻断剂进行了以下实验。我们选取S6K作为mTOR在活化或失活状态中变化的标志。首先,冈田酸(OA)是蛋白磷酸酶1(PP1)和蛋白磷酸酶2A (PP2A)的强效抑制剂,它可完全阻断ATP介导的p-AKT的去磷酸化,而对传统意义上的下游靶点分子量为40的富含脯氨酸的AKT底物(PRAS40)并没有影响。OA也不能逆转ATP对mTOR信号通路和对细胞生长的抑制。PI3K的抑制剂LY294002,几乎可以完全阻断AKT-PRAS40-S6K在基础水平的磷酸化。与理论推断一致,雷帕霉素抑制S6K磷酸化的程度和ATP相似。表明生理条件下,在肿瘤细胞中PI3K/AKT-PRAS40是mTOR信号通路的上游。其次,复合物C(CC)是AMPK信号分子的抑制剂,我们用CC阻断AMPK的活化可完全逆转ATP引起的S6K磷酸化水平的降低。PRAS40是公认的AKT的下游靶点,和p-S6K相似,ATP引起的PRAS40的磷酸化水平的降低可完全被CC逆转,表明AMPK-PRAS40-mTOR是一条新的ATP诱导肿瘤杀伤的信号通路。最后,和ATP相似,雷帕霉素能显著诱导肿瘤细胞中自噬分子LC3-Ⅱ的表达。而OA或CC能明显降低LC3Ⅱ在基础水平或ATP诱导情况下的表达,单独OA或CC干预都无法逆转ATP引起的细胞死亡。并且,单独用CC干预肿瘤细胞可显著抑制细胞生长(P=0.002)。此外,阻断PI3K/AKT (LY294002)或者mTOR(雷帕霉素)两条通路中的任意一条或两条,都可诱导细胞死亡,但和ATP相比,引起细胞死亡的程度弱很多。3、P2X7受体调控ATP诱导肿瘤细胞死亡通过RT-PCR分析MCA38细胞中P2受体家族mRNA的表达情况,MCA38细胞表达P2X3(最少),P2X4-5, P2X6(弱),P2X7, P2Y1, P2Y12-14。BzATP是特异性P2X7受体激动剂,随后,我们用BzATP处理MCA38和B16／F10肿瘤细胞,发现BzATP抑制细胞生长,并且诱发细胞内信号通路的改变,和ATP引起的改变完全一致。而P2X5, P2Y2,P2Y4和P2Y6受体的激动剂UTP,对肿瘤细胞的生长无影响。此外,非特异性P2受体拮抗剂苏拉明(Suramin,抑制P2X1-3, P2X5, P2Y1-2, P2Y6和P2Y11-13受体),可阻断ATP诱导的AMPK信号通路的激活,但不能逆转ATP对AKT、PRAS40和S6K磷酸化和对肿瘤细胞生长的抑制作用。同时,选择性P2X7受体拮抗剂KN-62,可逆转ATP介导的信号通路的改变,呈时间和浓度依赖性。4、P2X7基因沉默可保护肿瘤细胞免受ATP的肿瘤杀伤作用我们应用慢病毒P2X7shRN A转染MCA38和B16／F10细胞,构建稳定的P2X7基因沉默的肿瘤细胞株。在四种P2X7shRNA中,其中一种,几乎完全阻断了MCA38和B16／F10两种肿瘤细胞中P2X7蛋白的表达。P2X7基因缺陷的肿瘤细胞几乎完全逆转了ATP在以下方面对肿瘤细胞的抑制作用：细胞信号传导通路,细胞生长,克隆形成能力和细胞白噬。和对照细胞相比,P2X7基因沉默细胞具有更强的增殖和克隆形成潜能。表明P2X7受体,至少是在很大程度上,将高水平的细胞外ATP信号传递至细胞内,促进肿瘤细胞死亡5、细胞外ATP诱导对P2X7受体通道功能的影响首先,通过RT-PCR检测P2X7受体两种剪切异构体(splice variant)的表达,发现在mRNA水平,MCA38细胞和B16／F10细胞都只表达P2X7(a)。其次,以溴化乙锭摄取实验评估P2X7通道功能尤其是细胞表面孔洞的形成,发现在两种细胞中,胞外高浓度ATP能显著刺激对溴化乙锭的摄取。第三,以HPLC方法测定胞外高浓度ATP处理肿瘤细胞后,细胞内ATP, ADP和AMP的浓度的变化情况,发现细胞内ATP浓度继发性降低,同时伴随ADP和AMP水平及AMP/ATP比率的显著升高,以上发现和ATP-P2X7诱导AMPK信号通路激活的结果一致。第四,接下来通过应用拮抗剂研究证实,P2X7受体激活导致PI3K/AKT和AMPK/mTOR信号通路的改变,与原始孔洞形成转载蛋白(包括pannexin-或connexin-类型的通道)以及活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)无关。生胃酮(CBX, pannexin-或connexin-类型的药理学抑制剂)和N-乙酰半胱氨酸(NAC,广谱抗氧化剂)对ATP诱导的P2X7信号通路级联反应都无影响。最后,我们发现P2X7受体激活可导致肿瘤细胞自噬,特异性药理学抑制剂(如Z-VAD-fmk,细胞凋亡蛋白酶抑制剂,或凋亡特异性抑制剂Necrostatin-1)都不能逆转ATP诱导的肿瘤细胞死亡。6、Ca2+信号和ATP-P2X7介导的肿瘤杀伤活性无关我们选取了两种改变细胞内Ca2+水平的化学药物进行了以下实验。BAPTA-AM和毒胡萝卜素(TG), BAPTA-AM是选择性细胞通透的钙离子螯合剂,可降低细胞质内钙离子浓度；毒胡萝卜素(TG),是高效的内质网Ca2+-ATP酶抑制剂,能导致细胞质内Ca2+水平迅速升高。我们发现BAPTA-AM不能逆转ATP诱导的mTOR信号通路的抑制和LC3-Ⅱ水平的增加,但可以完全阻断P13K／AKT和mTOR通路以及LC-3Ⅱ在基础水平的激活,对AMPK信号通路没有影响,同时也可显著诱导细胞死亡。TG可激活AMPK信号通路,但是对PI3K/AKT和mTOR通路及细胞自噬无影响。结论1、细胞外高浓度ATP可直接抑制细胞增殖,并可诱导细胞自噬引起肿瘤细胞死亡,且呈时间和浓度依赖性；2、ATP介导的细胞毒性通过激活两条独立的信号传导途径实现,分别是AMPK-PRAS40-mTOR和PI3K/AKT信号通路；3、P2X7受体是ATP介导的信号通路上游调控的关键分子,ATP-P2X7诱导肿瘤细胞死亡是通过细胞内核苷酸外流诱导细胞凋亡和坏死实现的；4、生理条件下,一定浓度的Ca2+是肿瘤细胞生长必需的,与ATP诱导的细胞毒性无关。总之,我们推断出高浓度的细胞外ATP通过激活P2X7受体将细胞外的杀伤信号传递至细胞内新发现的P2X7-AMPK-PRAS40-mTOR轴和传统的P2X7-PI3K/AKT轴,协同调控细胞自噬和生长,最终导致肿瘤细胞死亡。P2X7作为肿瘤治疗的新的潜在靶点,为将来以嘌呤信号为基础的靶向药物的开发提供了理论依据。