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白酒是中国特有的一种蒸馏酒,由淀粉或糖质原料与发酵剂大曲混合制成酒醅或发酵醪,通过大曲和自然环境中不同微生物群落演替发酵经蒸馏而得。目前,由于白酒酿造仍然处在纯手工操作阶段,生产过程中存在很多不确定因素,导致白酒的产量和质量非常不稳定。为了明确白酒发酵过程中优势微生物的功能,为质量控制和之后的机械化生产奠定基础,本文以发酵工艺相对简单的清香型白酒大茬发酵酒醅和国内外不同酒厂发酵酒醅作为研究对象,采用传统的微生物分离、高效液相色谱、项空固相微萃取结合气相色谱质谱和基因编辑等技术手段相结合的方法,对白酒发酵酒醅中优势菌株的功能和遗传改造进行了研究,主要研究内容和结果如下: 1、对清香型白酒整个发酵过程根据温度变化趋势共设计了11个采样时间点,每个采样点分别对地缸酒醅中不同空间位置进行样品采集、酶学特性和理化性质分析,最终共采集29份样品,发现酒醅发酵整个过程中的液化酶无明显变化趋势,均呈现比较低地酶学活性;而糖化酶是0到13天先增长后下降的变化趋势。证实0-13天是清香型白酒酒醅发酵过程中液化糖化的主要阶段,其主要菌种是扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)和总状横梗霉(Lichtheimia ramose),并筛选了糖化酶和液化酶高的主体菌株。 2、本研究证实清香型白酒主体发酵阶段的酵母菌为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),并从国内外不同酒厂发酵酒醅中分离了大量酿酒酵母菌株,比较了其产生风味物质的差异和遗传差异,以揭示我国白酒的风味多样性是否与主体发酵酵母菌的遗传多样性有关。模仿清香型白酒的传统工艺,通过双酶法(液化酶和糖化酶)糖化高粱用于不同酒厂分离的酿酒酵母单菌种或混合种发酵,液相色谱和气相色谱质谱分析,发现不同酒厂来源的酿酒酵母纯种发酵高粱醪液所产生的风味物质差异明显,并发现酿酒酵母与一种优势乳酸菌混合发酵可产生更加丰富的风味物质,明确不同菌种的主要风味组分,筛选并保存优良菌种。多基因,包括UTP14、IntMD、IntCG和IntAY的序列分析表明不同酒厂分离的酿酒酵母菌株也具有明显的遗传差异,并揭示了其种群关系。 3、利用新一代基因编辑技术成功定向实现对酿酒酵母高级醇含量调控基因Bat2的改造敲除,获得Bat2基因敲除的HN6a酿酒酵母菌株。 通过本次研究,对清香型白酒发酵过程中优势菌株的关键功能有明确的认识,认清不同酒厂分离的酿酒酵母的遗传关系和风味物质特征,同时对酿酒酵母菌的遗传改造进行了初步探究。结果对优良功能菌株筛选和复配提供了依据,且为定向改变酿酒酵母风味组分指明方向,并为下一步利用这些主体菌株用于清香型白酒机械化、自动化发酵打下了基础。