背景肝癌目前已成为全球范围内位居癌症发病率第5、癌症死亡率第3的癌症类型,而我国的肝癌发病率和致死率都为世界最高,肝癌患者数量可占到全球总数的一半[1],肝癌已经成为一种严重威胁到我国人民生命健康的恶性疾病,主流的治疗方法包括肝部分切除、消融治疗、介入治疗、分子靶向治疗及放化疗等,虽然对肝癌已大多采取综合治疗措施,但大多数患者的预后仍然较差。现在已有许多证据表明,肝细胞内长期反复累积的致癌基因激活、抑癌基因失活、周期调控等基因的突变,可逐渐导致肝癌的病理发生[2],如Ras基因产物可参与到调控基因转录的激酶信号传导通路,进而对细胞的生长与分化产生影响,该基因可通过点突变而被激活为致癌基因,在至少50%的人类HCC中发现了Ras/MAPK通路的激活[3];又如PTEN可以通过水解作用降低下游信号分子活性以抑制细胞的增殖、生长,使细胞发生凋亡,而当该基因发生错义突变或片段丢失后,PTEN的酶活性被减弱,随即失去抑癌作用[4]。理论上,上述基因都有成为肝癌治疗靶点的可能性[5-7],因此,随着基因研究的深入,基因治疗有可能在肝癌的治疗中取得较好的前景[8,9]。Tg737基因首先于藻类中被发现,由其编码的蛋白是鞭毛内运输蛋白88(intraflagellar transport 88,IFT88)的同系物,二者均为鞭毛和纤毛的重要组成部分,Tg737较早就被发现在多囊肾病的发病过程中起到一定作用[10],而近年来的研究发现Tg737也是一个可能在肝癌细胞系中发挥作用的抑癌基因,有研究[11]报道,Tg737在59%的肝癌组织中发生了表达量的下调,此外,该基因还被报道能影响到细胞的周期、增殖与凋亡[12],并参与到肝癌细胞在低氧条件下的侵袭转移[13]等过程。目的本研究拟通过在HepG2细胞中过表达Tg737,初步探究其在肝癌细胞凋亡、周期、迁移和侵袭等方面是否发挥作用,以期为临床肝癌的基因治疗提供新的治疗靶点。方法1、构建Tg737过表达HepG2细胞模型:通过脂质体介导的瞬时转染方法,提高HepG2细胞中Tg737的表达,Western blot方法验证过表达效果。将实验细胞分为4组:转染pcDNA3.1-Tg737质粒组(实验组)、脂质体孵育组(脂质体组)、转染载体pcDNA3.1(-)组(空载体组)及未转染组(空白对照组)。2、检测过表达Tg737对HepG2细胞周期和凋亡的影响:转染后48h,流式细胞术检测上述各组细胞周期分布,Annexin V/PI双染法、形态学方法检测细胞凋亡情况,Western blot方法检测细胞周期和凋亡相关分子蛋白表达变化。3、检测过表达Tg737对HepG2细胞迁移和侵袭能力的影响:转染后24h,Transwell迁移实验、侵袭实验,鬼笔环肽染色实验检测上述各组细胞侵袭、迁移能力的变化,Western blot检测EMT相关分子蛋白表达变化。结果1、转染后24h及48h,运用Western blot方法检测出实验组中Tg737含量明显高于脂质体、空载体及空白对照组(均P<0.05),而3个对照组间并无明显差异(均P>0.05),证实了实验组中Tg737的过表达效果,并且排除了脂质体或质粒有可能对过表达效果造成的干扰。2、转染后48h,流式细胞术检测细胞周期显示,实验组中处于S期的细胞数量相较于对照组明显增多,处于G0/G1期及G2/M期细胞数量减少(均P<0.05);Annexin V/PI法检测细胞凋亡显示,正常情况下存在少量的凋亡及坏死细胞,而转染后48h,与对照组相比,实验组正常细胞比例明显减少,凋亡比例明显升高(均P<0.05),但坏死细胞数量无明显变化(均P>0.05)。通过形态学检测方法发现,实验组细胞发生了明显的凋亡形态学改变,而对照组细胞则无明显变化。Western blot方法结果显示cyclin A、Bax蛋白表达量明显升高,Bcl-2蛋白表达量明显下降(均P<0.05)。3、转染后24h,Transwell迁移实验、侵袭实验表明实验组细胞的迁移能力和侵袭能力明显弱于对照组(均P<0.05);鬼笔环肽染色显示对照组细胞表面可见明显的伪足,而实验组细胞则几乎没有;Western blot方法检测EMT相关蛋白表达水平显示,实验组细胞内E-cadherin表达量升高,Vimentin、Fibronectin表达量下降(均P<0.05)。结论1、过表达Tg737基因能使HepG2细胞发生周期阻滞,增加凋亡比例,可能通过由Tg737参与调节的cyclin A,Bax,Bcl-2信号通路起作用,进而抑制细胞增殖。2、过表达Tg737基因能降低HepG2细胞侵袭转移能力,机制可能与逆转EMT过程有关。