【摘 要】
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根据GenBank中所登录的各种真菌铜锌型超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)与锰型超氧化物歧化酶(Mn-SOD)基因的氨基酸序列及核苷酸序列,设计一对简并引物,RT-PCR扩增蛹虫草(Cordyceps
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根据GenBank中所登录的各种真菌铜锌型超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)与锰型超氧化物歧化酶(Mn-SOD)基因的氨基酸序列及核苷酸序列,设计一对简并引物,RT-PCR扩增蛹虫草(Cordyceps militaris)两种SOD基因中间片段.利用RACE-PCR的方法得到两种SOD基因的3末端和5末端.序列拼接获得两种SOD(CuZnSOD和Mn-SOD)基因的全长cDNA.通过RT-PCR,扩增蛹虫草CuZn-SOD基因和Mn-SOD基因完整的编码区,将产物用BamHI和SalI进行双酶切,连入用同样酶切的pGEX-4T3载体上,构建了原核表达载体pGEX-sod19和pGEX-sod14.将原核表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,进行诱导表达,经SDS-PAGE电泳,发现两个载体都表达出了相应的融合蛋白.利用pBI121载体,将CuZn-SOD和Mn-SOD基因分别构建植物表达载体pBIsod14和pGEX-sod19,转入农杆菌LBA4404中,通过叶盘法转化云烟85,期望得到SOD超量表达的转基因植物.在MS培养基上经过Kan筛选,得到两种表达载体的再生苗.提取再生植株叶子中的DNA,进行PCR检测,结果均呈阳性,通过Souther-blotting检测,证实所获得的是转基因植株.
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