目的:抑郁症、糖尿病与认知障碍有着密切关联,并能增加患痴呆的风险,临床上糖尿病患者常伴发抑郁症,二者并发能相互加重认知障碍的严重程度。现代药理研究表明知母具有改善糖尿病、抗抑郁症、改善认知障碍等功效,其主要为皂苷类成分,约占6%,本课题从抗细胞凋亡假说角度探索知母治疗抑郁症,糖尿病相关的认知障碍的作用机制。方法:1、模型的建立糖尿病伴抑郁模型大鼠的建立:雄性SD大鼠100只,根据体重及血糖血脂,采用半随机的方法分为9组,正常组(NK组),抑郁模型组(MD组),MD知母总皂苷组(ZMD组),每组10只;糖尿病模型组(DM组),糖尿病伴抑郁模型组(DD组),DM知母总皂苷组(ZDM组),DD知母总皂苷高剂量组(ZDD-H),DD知母总皂苷低剂量组(ZDD-L),DD 阳性药组(PDD),每组12只。采用慢性不可预见性刺激(CUMS)结合孤养造模法诱导抑郁模型,STZ+高脂饲料诱导2型糖尿病模型,孤养+CUMS+STZ+高脂诱导复合模型,通过连续灌胃知母总皂苷共17周。2、从抗细胞凋亡角度探索知母治疗糖尿病、抑郁性认知损伤的机制每周记录各组大鼠体重,给药12周,检测大鼠血浆中血糖血脂、谷氨酸(GLU)、Aβ 1-42蛋白(Aβ 1-42)、脑源性神经营养因子(BDNF)含量;给药14周,对各组大鼠进行糖耐量测试(OGTT),以旷场实验(Open-field实验)、Barnes迷宫实验评价大鼠行为学;给药17周以后,大鼠麻醉,腹主动脉采血,检测血浆空腹血糖(FPG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL),解剖大鼠大脑,分离海马组织,检测谷氨酸(GLU)、Aβ蛋白(A β 1-42)含量,HE染色观察大鼠海马的病理改变,免疫组化实验检测各组大鼠海马NR2A、NR2B、p-JNK、BCL-2、BAX、Caspase-3蛋白的表达,实时荧光定量 PCR检测各组大鼠海马 NR2A mRNA、NR2B mRNA、JNK mRNA、BCL-2 mRNA、BAX mRNA、Caspase-3 mRNA的表达。结果:1、外在指标的评价由于抑郁造模,MD组、DD组大鼠体重明显低于正常组,由于糖尿病造模,DD组大鼠的体重会比MD组高,DM组由于STZ腹腔注射量,体重与正常组并没有明显差异,抑郁模型在知母给药后,体重并没有明显变化,但是糖尿病模型组给药后明显降低。旷场实验(Open-field)中,抑郁造模大鼠活动次数明显减少,抑郁行为学特征明显,通过知母给药能显著改善大鼠的抑郁行为学状态。Barnes迷宫实验中,与正常组相比,各模型组大鼠的认知、空间记忆能力都明显下降;与各模型组相比,各给药组大鼠的学习记忆能力得到提高,其中高剂量组的效果比低剂量组稍明显。2、大鼠血液、组织指标的研究通过给药6周、12周、17周的血糖测试得出,与正常组比较,MD组大鼠血糖稍微低于正常组,给药后不惧显著差异;与正常组比较,DM组大鼠的空腹血糖(FPG)、总胆固醇(TC)明显升高(P<0.01),与正常组比较,DD组大鼠有血糖升高趋势,但趋势低于DM组;与DM组比较,知母总皂苷能明显抑制ZDM组FPG、TC的升高。给药12周后,与正常组比较,MD、DM组大鼠血浆Aβ 1-42蛋白,谷氨酸都明显升高(P<0.05或P<0.01),而复合模型组大鼠A β 1-42蛋白,谷氨酸没有明显统计学意义;与MD、DM组比较,知母总皂苷能明显降低ZMD、ZDM组大鼠血浆Aβ 1-42蛋白,谷氨酸水平(P<0.01或P<0.05),虽然DD组与正常组相比没有明显统计学意义,但是其相应知母总皂苷给药组能降低谷氨酸水平(P<0.01或P<0.05);与正常组比较,三个模型组大鼠的BDNF都显著降低(P<0.01),但是通过知母给药后,各组BDNF没有升高,差异没有统计学意义。给药17周后,MD、DM、DD组大鼠海马组织A β 1-42蛋白,谷氨酸都明显升高(P<0.01),与两个单独模型组相比,DD组大鼠Aβ 1-42蛋白,谷氨酸稍高,有一定的模型叠加趋势,但不具有统计学意义;与相应模型组比较,知母总皂苷能明显降低各组大鼠海马组织Aβ 1-42蛋白,谷氨酸水平(P<0.01或P<0.05)。通过HE染色观察各组大鼠海马CA1区神经元,结果显示正常组大鼠海马区细胞完整且细胞密集,神经元排列整齐,着色均匀,形态规则,细胞核大而圆;MD、DM、DD模型组大鼠海马神经元数量减少,大量细胞核固缩,细胞间空隙加深,出现一些不规则神经元,呈坏死状态小胶质细胞增多。3、通过NR-JNK-BCL-2、BAX、Caspase-3通路探索知母改善认知损伤的作用本研究结合糖尿病伴抑郁模型大鼠,观察大鼠海马CA1区NR2A、NR2B、p-JNK、BCL-2、BAX、Caspase-3蛋白的平均光密度值;结果显示,与正常组相比,三个模型组NR2A、NR2B、p-JNK、BAX的光密度值升高(P<0.05或P<0.01),Caspase-3没有统计学意义;知母总皂苷给药后,各模型组NR2A、NR2B、p-JNK、BAX的光密度值降低(P<0.05 或P<0.01)。通过实时荧光定量PCR检测,结果显示,正常组相比,三个模型组NR2A mRNA、NR2B mRNA、JNK mRNA、BAX mRNA的表达量升高或有明显升高趋势,BCL-2 mRNA表达量降低(P<0.05或P<0.01),Caspase-3 mRNA表达量没有统计学意义;知母总皂苷给药后,各模型组NR2A mRNA、NR2B mRNA、JNK mRNA、BAX mRNA表达量降低或有明显降低趋势,BCL-2 mRNA表达量升高(P<0.05或P<0.01)。结论:1、体重结果显示知母能降低糖尿病模型大鼠体重,对抑郁模型没有影响,说明当体内有异常脂肪聚集的时候,知母总皂苷能发挥其降脂的作用。知母总皂苷具有通过改善抑郁大鼠行为学状态,降低谷氨酸的累积,达到抗抑郁的作用,也具有降低空腹血糖、总胆固醇、提高血糖耐受力,达到治疗糖尿病的作用。2、通过实验证明,知母总皂苷具有降低糖尿病模型和抑郁模型的血浆和海马组织Aβ1-42蛋白、谷氨酸的含量,并改善大鼠学习记忆能力,调节NMDA NR-JNK-BCL-2、BAX引发的细胞凋亡通路,说明糖尿病和抑郁症有着相似认知损伤的机制,知母总皂苷通过调节这个通路从而起到改善认知损伤的作用。而知母总皂苷对BDNF并没有显著的提高作用,这可能使与Caspase-3的结果没有明显的调节作用有关。