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第一部分影响早期胚胎发育的卵丘细胞中mRNA表达谱的研究 【目的】本实验采用Arraystar human mRNA表达谱芯片技术检测人MⅡ卵母细胞周围卵丘细胞中对影响早期胚胎发育的 mRNAs表达水平，并对差异表达的mRNAs进行筛选分析和验证。 【方法】 1.收集在我中心接受IVF-ET治疗的患者的卵丘细胞，按照胚胎质量各自对应分组，发育成优质胚胎的卵母细胞周围的卵丘细胞为优质胚胎卵丘细胞组（A组）,发育成劣质胚胎的卵母细胞周围的卵丘细胞为劣质胚胎卵丘细胞组（B组）。检测6个样本的RNA总量以保证符合芯片检测要求。对卵丘细胞样本中RNA通过逆转录获得Cy3荧光染料标记的aRNA，采用Arraystar Human mRNA V2.0表达谱芯片（8x60K，Arraystar）检测卵丘细胞样本中mRNA表达水平，Agilent Feature Extraction(version11.0.1.1)软件提取获得的微阵列图像原始信号值，GeneSpring GX verision12.1软件包(Agilent Technologies)对获取的mRNA原始信号值进行标准化处理并质量评估。 2.采用两分类的差异基因筛选方法对差异mRNAs进行筛选，火山图和聚类分析图显示两组卵丘细胞中差异mRNAs表达情况。应用基因富集分析方法进一步分析差异表达的mRNAs，分别进行GO分析和KEGG pathway分析。 3.差异mRNAs的Real-time PCR验证筛选相关的mRNAs，挑选目的基因，采用实时定量PCR验证其表达水平。 【结果】 1.对接受IVF-ET治疗患者中，选取的3例患者6个样本的卵丘细胞经检测均符合mRNA表达谱芯片检测的要求。其中，A组样本（4A、5A、7A）中RNA OD260/280比值分别为1.95、1.92、2.04；B组样本（4B、5B、7B）中RNA OD260/280比值分别为2.05、2.00、1.94。两组样本符合芯片检测实验要求。对卵丘细胞样本中RNA进行反转录并用Cy3荧光染料进行标记，特异性标记活性为（pmol/μl染料）/(μg/μl cRNA），A组（4A、5A、7A）分别为21.42、21.70、20.64，B组（4B、5B、7B）分别为21.25、21.47、21.00，符合芯片检测实验要求。两组样本中共检测到mRNA靶基因数15797个；过滤后数据质量评估，用箱体图分析显示6个样本mRNAs表达水平接近在一个水平。散点图分析结果显示两组卵丘细胞中存在大量差异表达的mRNAs。 2.两样本间差异表达mRNAs的筛选分析，检测到差异表达的mRNAs810个，其中B组vs A组上调表达的mRNAs是91个，B组vs A组下调表达的mRNAs是719个。对差异表达的mRNAs进行GO分析，结果显示，B组vs A组上调表达的mRNA中，参与生物学过程的基因数是112个，参与细胞组成的基因数是24个，参与分子功能的基因数是22个。在B组vs A组下调表达的mRNA中，参与生物学过程的基因数是389个，参与细胞组成的基因数是94个，参与分子功能的基因数是85个。对差异表达的mRNAs信号通路分析，结果显示，B组vs A组上调表达的mRNA基因参与了5条信号通路，下调表达的mRNA基因参与了12条信号通路。 3.挑选差异基因RT-PCR验证结果进行实时荧光定量PCR验证，结果与芯片表达结果一致。 【结论】 发育成不同质量卵裂期胚胎的人 MⅡ期卵母细胞周围的卵丘细胞间存在大量差异表达的 mRNAs；GO分析和pathway分析提示卵丘细胞中这些差异表达的mRNAs参与了各种生物学途径和信号通路对早期胚胎发育的调控。这些 mRNAs的表达上调或下调，可能进一步导致蛋白质的表达变化，从而影响卵母细胞的发育和早期胚胎的发育。 第二部分影响早期胚胎发育的卵丘细胞中lncRNA表达谱的研究及其与 mRNA关联分析 【目的】本实验采用Arraystar human lncRNA表达谱芯片技术检测人MⅡ卵母细胞周围卵丘细胞中对影响早期胚胎发育的 lncRNAs表达水平，对差异表达的lncRNAs进行筛选分析和验证。并将差异表达的lncRNAs与mRNAs关联分析。 【方法】 1.收集在我中心接受IVF-ET治疗的3名患者的卵丘细胞，按照胚胎质量各自对应分组，发育成优质胚胎的卵母细胞周围的卵丘细胞为优质胚胎卵丘细胞组（A组）,发育成劣质胚胎的卵母细胞周围的卵丘细胞为劣质胚胎卵丘细胞组（B组）。检测6个样本的RNA总量以保证符合芯片检测要求。对卵丘细胞样本中RNA通过逆转录获得Cy3荧光染料标记的aRNA，采用Arraystar Human lncRNA V2.0表达谱芯片（8x60K，Arraystar）检测卵丘细胞样本中lncRNA表达水平，Agilent Feature Extraction(version11.0.1.1)软件对获得的微阵列图像提取原始信号值，GeneSpring GX软件包(Agilent Technologies，verision12.1)对获取的lncRNA原始信号值进行标准化处理并质量评估。 2.采用两分类的差异基因筛选方法对差异 lncRNAs进行筛选，火山图和聚类分析图显示两组卵丘细胞中差异lncRNAs表达情况。根据lncRNA在染色体上的位置和已知功能分类对芯片检测出来的差异表达 lncRNA进行分类和亚组分析。 3.筛选相关的lncRNAs，挑选目的lncRNAs，采用实时定量PCR验证其表达水平。根据芯片数据比较差异mRNAs和lncRNAs，试图寻找出共同表达上调或者下调的基因。以与卵丘细胞、早期胚胎发育密切相关为基础，对于 PCR结果与芯片结果一致的mRNAs和lncRNAs，分别采用CNC网络图分析，建立二者之间的联系，并初步构建lncRNA与mRNA的调控网络。 【结果】 1.对接受IVF-ET治疗患者中，选取的3例患者6个样本的卵丘细胞经检测均符合 lncRNA表达谱芯片检测的要求。其中，A组样本（4A、5A、7A）中RNA OD260/280比值分别为1.95、1.92、2.04；B组样本（4B、5B、7B）中RNA OD260/280比值分别为2.05、2.00、1.94。两组样本符合芯片检测实验要求。对卵丘细胞样本中RNA逆转录并用Cy3荧光染料进行标记，特异性标记活性为（pmol/μl染料）/(μg/μl cRNA），A组（4A、5A、7A）分别为21.42、21.70、20.64，B组（4B、5B、7B）分别为21.25、21.47、21.00，符合芯片检测实验要求。两组样本中共检测到lncRNA20563个；过滤后数据质量评估，用箱体图分析显示6个样本的lncRNAs表达水平接近在一个水平。散点图分析结果显示两组卵丘细胞中存在大量差异表达的lncRNAs。 2.两样本间差异表达lncRNAs的筛选分析，检测到差异表达的lncRNAs共633个，其中B组vs A组上调表达的lncRNAs是124个，B组vs A组下调表达的lncRNAs是509个。对lncRNA亚组分析：发挥增强子功能的lncRNAs有925个，增强子附近编码基因的有166个；HOX簇序列的lncRANs有387个；位于基因间的 lncRNA(LincRNAs)有2041个，LincRNAs附近的编码基因有373个。 3.部分差异lncRNAs进行实时荧光定量PCR验证，结果与芯片表达结果一致。根据芯片数据，筛选比较了差异mRNAs和lncRNAs，筛选出共同表达的基因分别为：ASNS、CALB2和NEK7，对应的 lncRNAs分别为：ENST00000429197、NR_027910和Y00062。三对mRNAs/lncRNAs在B组vs A组中均是下调表达。 【结论】 1.发育成不同质量卵裂期胚胎的人MⅡ期卵母细胞周围的卵丘细胞间存在大量差异表达的lncRNAs，提示了卵丘细胞中这些差异表达的lncRNAs可能参与了对早期胚胎发育的调控机制；对lncRNAs的亚组分析提示有很多不同功能的lncRNAs参与mRNAs的转录水平的调节、表观遗传的修饰，对基因的表达起着一定的调控作用。 2. LncRNA-mRNA关联分析，结果提示 ASNS、CALB2和NEK7与对应的lncRNAs ENST00000429197、NR_027910和Y00062在优质胚胎来源的卵丘细胞中上调表达，提示该三对mRNAs/lncRNAs在卵丘细胞调控早期胚胎发育的机制中可能有相关性。