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柚(Citrus maxima)是柑橘基本种之一,在柑橘中具有重要的生物学地位,同时在中国柑橘产业上占有重要的经济地位。中国是柚类的原产国和主要栽培国之一。根据《禹贡》的记载,柚在中国已有4,000多年的栽培历史。柚多以实生繁殖,在不同的地理环境下,形成了现在丰富多样的种质资源。然而由于各种原因,有些古老品种正在逐渐丢失,且柚类资源的调查和保护工作又比较滞后,对于中国丰富多样的柚类遗传资源,目前尚无比较全面的群体遗传学研究;且多数研究主要针对果实性状进行,而对于叶片的研究比较缺乏。本研究从全国柑橘适栽地区广泛收集柚类资源,包括主栽品种和地方品种,基于n SSR标记技术,分析了中国柚类资源的遗传多样性和群体结构,为中国柚类传播提供了遗传学的证据;进一步通过全基因组重测序技术,开展了琯溪蜜柚果肉色泽突变体研究,挖掘可能与果肉色泽相关的SNP位点;围绕琯溪蜜柚叶片渐绿性状,构建了有性分离群体,挖掘渐绿突变相关的候选基因,为柚遗传改良提供群体基础。主要结果如下:1.柚群体遗传多样性、群体结构及色泽突变分析2010-2013年,连续4年时间从全国13个柚类适栽省份收集了近300份的柚种质资源,其中包含经济栽培品种60份,地方品种212份,柚类杂种2份。该柚类自然群体资源表型丰富,其中果肉为白色的资源有109份,果肉为红色有113份,少数资源果肉为绿色;其它果实性状,如果实大小、果形、种子数、果皮厚度等,均表现出丰富的遗传多样性,表明柚资源收集比较全面。应用定位于柑橘9条染色体上的31对多态性n SSR引物对该自然群体进行多样性分析,共扩增得到147个多态性条带,平均每个位点检测到4.7条带,平均观测杂合度(Ho)为0.325,平均期望杂合度(He)为0.430,31对引物的多态信息含量(PIC)平均值为0.414。群体结构预测显示该自然群体具有2个基本的基因库(K=2),即亚群A与亚群B,且这2个亚群与地理分布相关;其中,亚群A包含中国东南地区大多数品种和中国南方中部地区的部分品种,亚群B则主要由中国西南地区的大多数品种和中国南方中部地区的部分品种组成。与亚群A的Ho(0.307)和He(0.368)相比,亚群B的Ho和He的值分别为0.345和0.465,反映出中国西南地区的柚品种具有较高的杂合度。结合群体结构(K=3)、主成分分析(PCo A)和系统发育分析的结果表明,收集的柚自然群体可分为三个亚群:Pop-a(主要由中国东南地区的品种组成)、Pop-b(主要由中国南方中部的柚品种组成)和Pop-c(主要由中国西南地区的柚品种组成)。分子标记结果显示,Pop-b可能是在柚传播过程中由两个基因库交汇而形成的一个新的多样性子群。瓶颈效应分析发现中国柚自然群体在近期驯化经历了一个微弱的瓶颈效应,并未造成种群有效种群数目的大量减少。以收集的白肉琯溪蜜柚及其突变体红肉琯溪蜜柚为材料进行全基因组重测序,基于生物信息学分析,挖掘到5个差异SNP位点,其中一个SNP位点验证为阳性,且该差异SNP位点为琯溪蜜柚红肉突变体的汁胞层所特有。序列分析显示该位点在白肉琯溪蜜柚中为纯合T,而红肉琯溪蜜柚中由T突变成T/G杂合,导致该位点所在基因(Ci PR)可以继续编码81个氨基酸。进一步分析Ci PR基因在琯溪蜜柚不同发育时期果肉内的表达模式发现,在150 DAF(花后天数)红肉琯溪蜜柚高积累番茄红素时期,Ci PR基因在红肉琯溪蜜柚的表达量高于白肉琯溪蜜柚。将Ci PR基因转化柑橘愈伤,分析超表达阳性系愈伤组织的类胡萝卜素通路基因的表达模式,结果显示相关基因在表达上并没有显著差异,表明该SNP可能是柚类的一个多态性位点。2.琯溪蜜柚叶片渐绿性状研究叶片渐绿突变体琯溪蜜柚(CP)为琯溪蜜柚芽变品种,果皮橙色,叶片有渐绿(缓慢绿化或延迟绿化)性状。以其为母本,晚白柚(WBY)为父本构建有性杂交分离群体,获得551株杂交F1分离后代,其中135株叶片具有渐绿性状(MCW),416株叶片为正常绿叶的表型(WCW)。对MCW和WCW幼年叶片的色素含量分析显示,MCW的叶绿素和类胡萝卜素的含量均显著低于WCW(P<0.05)。将亲本CP,WBY,50株渐绿子代混池和50株绿叶子代混池分别提取DNA进行基因组重测序,测序深度分别为27.73×、31.32×、60.18×和57.06×,亲本测序结果的基因组覆盖度约为75%,混池的基因组覆盖度约为80%。BSA(bulk segregant analysis)分析显示与渐绿性状相关的区域位于6号染色体上,候选区域长度为1.45 Mb。开发6个In Del标记将候选区域缩小到包含22个候选基因的0.2 Mb范围内。对这22个候选基因进行表达模式的分析,挖掘到4个在子代之间表达差异显著的基因,分析4个基因的c DNA序列,未发现与性状关联的差异位点。将这4个基因进行烟草(Nicotiana benthamiana)瞬时表达,结果显示超表达Chl660基因的烟草叶片中叶绿素含量显著低于空载(P<0.05)。基因Chl660预测的功能为编码YLS9(Yellow-leaf specific gene)蛋白,亚细胞定位显示该基因位于叶绿体上,说明该基因很可能参与琯溪蜜柚叶片渐绿性状的形成。