研究背景：类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis、RA)是造成人类丧失劳动力和致残的主要疾病之一,具有慢性、进行性、侵袭性的特点；因此,早期诊断和治疗至关重要。已有研究证实,人体免疫系统失衡造成的T细胞功能失调不仅是RA的发病原因之一,而且在RA患者不同的预后、转归中发挥着不容忽视、甚至是决定性的作用。但在RA患者中免疫系统对T细胞的调节作用机制尚不明确。众多研究表明,多种免疫调节因子在RA中的T细胞功能失调中发挥着重要作用。Tim-3(T cell immunoglobulin-and mucin-domain-containing molecule-3,Tim-3)与PD-1(programmed death-1)是影响T细胞功能的重要免疫调节因子。Tim-3是在2002年被发现的,特异性表达在分化终末期的Thl细胞上的新型免疫调节分子。Tim-3与其配体之一galectin-9相互作用可负向调控干扰素gamma的产生,并可影响T细胞耐受的形成。PD-1主要表达在激活后的T细胞、B细胞和单核细胞,并通过召集SHP-2到磷酸化后的半胱氨酸来抑制免疫反应。我们的前期研究发现,Tim-3和PD-1在小鼠自身免疫疾病中对T细胞具有抑制作用,提示其在RA中很有可能具有调节并抑制T细胞过激的免疫反应并缓解炎症的作用。本课题利用临床研究和体外细胞实验研究Tim-3和PD-1在RA发生发展中的表达及功能,为进一步深入阐明RA相关疾病的发病机制提供实验依据,并为开拓新的治疗方法提供理论依据。方法：1.Tim-3在类风湿性关节炎患者体内的表达与RA疾病进展的关系1.1Tim-3在类风湿性关节炎患者外周血不同T细胞亚群中的表达收集不同严重程度的类风湿性关节炎患者和健康志愿者的新鲜外周抗凝血,流式细胞术检测Tim-3在外周血CD4+T细胞和CD8+T细胞中的表达。1.2Tim-3在类风湿性关节炎患者关节滑液不同T细胞亚群中的表达收集不同严重程度的类风湿性关节炎患者的新鲜关节滑液,流式细胞术检测Tim-3在滑液CD4+T细胞和CD8+T细胞中的表达。1.3Tim-3在类风湿性关节炎患者外周血不同T细胞亚群中的表达与DAS28评分的相关性的研究对类风湿性关节炎外周血不同T细胞亚群上Tim-3的表达与患者DAS28评分进行Pearson相关性分析。1.4Tim-3在类风湿性关节炎患者关节滑液不同T细胞亚群中的表达与DAS28评分的相关性的研究对类风湿性关节炎关节滑液不同T细胞亚群上Tim-3的表达与患者DAS28评分进行Pearson相关性分析。2.Tim-3对类风湿性关节炎患者T细胞功能影响的研究2.1Tim-3对T细胞增殖功能的研究收集类风湿性关节炎患者和健康志愿者的新鲜外周抗凝血,利用阴性选择试剂盒分离出外周血T细胞,加入Tim-3封闭抗体或同型对照抗体后培育6天,利用CFSE染色分别检测CD4+T细胞和CD8+T细胞的增殖情况。2.2Tim-3对T细胞细胞因子分泌功能的研究收集类风湿性关节炎患者和健康志愿者的新鲜外周抗凝血,利用阴性选择试剂盒分离出外周血T细胞,加入Tim-3封闭抗体或同型对照抗体后分别检测CD4+T细胞和CD8+T细胞的IFN-γ和TNF-α的分泌情况。3.PD-1在类风湿性关节炎患者体内的表达与RA疾病进展关系以及机制3.1PD-1在类风湿性关节炎患者外周血不同T细胞亚群中的表达收集类风湿性关节炎患者和健康志愿者的新鲜外周抗凝血,流式细胞术检测PD-1在外周血CD4+T细胞和CD8+T细胞中的表达。3.2PD-1在类风湿性关节炎患者外周血不同T细胞亚群中的表达与CRP指标的相关性的研究对类风湿性关节炎外周血不同T细胞亚群上PD-1的表达与患者CRP指标进行Pearson相关性分析。3.3PD-1在类风湿性关节炎患者外周血不同T细胞亚群中的表达与DAS28评分的相关性的研究对类风湿性关节炎外周血不同T细胞亚群上Tim-3的表达与患者DAS28评分进行Pearson相关性分析。3.4PD-1对T细胞增殖以及细胞因子分泌功能的研究收集类风湿性关节炎患者和健康志愿者的新鲜外周抗凝血,利用阴性选择试剂盒分离出外周血T细胞,加入PD-1封闭抗体或同型对照抗体后培育6天,利用CFSE染色分别检测CD4+T细胞和CD8+T细胞的增殖情况。或检测CD4+T细胞和CD8+T细胞的IFN-y和TNF-a的分泌情况。4.统计学分析采用SPSS13.0软件对实验数据进行Student’s t检验、Mann-Whitney非参数U检验、Pearson相关性分析。p<0.05有统计学意义。结果：1.Tim-3在类风湿性关节炎患者体内的T细胞中表达升高,并与疾病进展呈负相关1.1Tim-3在类风湿性关节炎患者外周血T细胞的表达升高流式细胞术检测结果显示,Tim-3在类风湿性关节炎患者外周血CD4+T细胞和CD8+T细胞上的表达均显著高于健康志愿者对照(p<0.01),表明Tim-3在类风湿性关节炎中全身性免疫系统表达升高。1-2Tim-3在类风湿性关节炎患者关节滑液T细胞的表达升高为了更清楚地研究Tim-3在类风湿性关节炎患者体内的表达,我们收集类风湿性关节炎患者的关节滑液标本并利用流式细胞术检测Tim-3在关节滑液T细胞的表达。结果显示,患者的关节滑液CD4+T细胞的Tim-3表达不仅明显高于健康对照(p<0.001),而且明显高于患者外周血CD4+T细胞的Tim-3表达(p<0.01)。同样,患者的关节滑液CD8+T细胞的Tim-3表达不仅明显高于健康对照(p<0.001),而且明显高于患者外周血CD8+T细胞的Tim-3表达(p<0.01)。结果进一步表明Tim-3在类风湿性关节炎中的局部免疫系统表达升高,并表示其可能在炎症产生和发展中的作用。1.3Tim-3在类风湿性关节炎患者体内的表达与DAS28评分负相关统计学分析发现,类风湿性关节炎患者外周血CD4+T细胞、外周血CD8+T细胞、关节滑液CD4+T细胞和关节滑液CD8+T细胞上Tim-3表达水平均与患者DAS28评分呈负相关(分别为p=0.009,p<0.001,p=0.002,p=0.006),提示Tim-3很可能对类风湿性关节炎患者体内的CD4+T细胞和CD8+T细胞具有抑制作用,并通过抑制T细胞的功能缓解类风湿性关节炎的疾病发展。2.Tim-3对类风湿性关节炎患者T细胞的功能具有抑制作用2.1Tim-3对T细胞增殖功能具有抑制作用流式细胞仪检测结果显示,CD4+T细胞与Tim-3封闭抗体共同培育6天后增殖情况明显高于与同性对照抗体共同培育的CD4+T细胞(p<0.05)。同理,CD8+T细胞与Tim-3封闭抗体共同培育6天后增殖情况明显高于与同性对照抗体共同培育的CD8+T细胞(p<0.01)。表明Tim-3对T细胞增殖功能具有抑制作用。2.2Tim-3对T细胞细胞因子分泌功能具有抑制作用流式细胞仪检测结果显示,CD4+T细胞与Tim-3封闭抗体共同培育后IFN-γ和TNF-α分泌情况明显高于与同性对照抗体共同培育的CD4+T细胞(分别为p<0.05,p<0.01)。同时CD8+T细胞与Tim-3封闭抗体共同培育后IFN-γ和TNF-α分泌情况也明显高于与同性对照抗体共同培育的CD8+T细胞(分别为p<0.05,p<0.05)。表明Tim-3对T细胞的细胞因子分泌功能具有抑制作用。3.PD-1在类风湿性关节炎患者体内的T细胞中表达降低,并与疾病进展相关3.1PD-1在类风湿性关节炎患者外周血T细胞和血清中的表达降低流式细胞术检测结果显示,PD-1在类风湿性关节炎患者外周血CD4+T细胞和CD8+T细胞上的表达均显著低于健康志愿者对照(分别为p=0.002和p<0.001)。血清检测发现PD-1在患者血清中的含量与健康对照相比有明显降低(p<0.05)。3.2PD-1与类风湿性关节炎患者CRP结果呈负相关统计学分析发现,CRP结果呈阳性的类风湿性关节炎患者外周血CD4+T细胞的PD-1表达明显低于CRP结果呈阴性的类风湿性关节炎患者(p<0.001)。同样,CRP结果呈阳性的类风湿性关节炎患者外周血CD8+T细胞的PD-1表达明显低于CRP结果呈阴性的类风湿性关节炎患者(p<0.001)此结果提示PD-1表达与类风湿性关节炎患者CRP值相关联,并有可能作为检测类风湿性关节炎的疾病发展的指标之一。3.3PD-1在类风湿性关节炎患者体内的表达与DAS28评分负相关统计学分析发现,类风湿性关节炎患者外周血CD4+T细胞和外周血CD8+T细胞上PD-1的表达均与患者DAS28评分呈负相关(分别为p<0.001,p=0.001),提示PD-1可能参与类风湿性关节炎的疾病发展,并可以用作为描述类风湿性关节炎疾病发展的指标之一。3.4PD-1封闭抗体对T细胞增殖和细胞因子分泌无作用流式细胞仪检测结果显示,CD4+T细胞或CD8+T细胞与PD-1封闭抗体共同培育6天后增殖情况并无明显改变。而CD4+T细胞或CD8+T细胞与PD-1封闭抗体共同培育后IFN-y和TNF-a分泌情况亦无明显变化。表明PD-1封闭抗体对外周T细胞并不产生明显功效。结论：(1)Tim-3在类风湿性关节炎患者体内的T细胞中表达升高,并与疾病进展呈负相关。(2)Tim-3对类风湿性关节炎患者T细胞的功能,包括CD4+T细胞和CD8+T细胞增殖,CD4+T细胞和CD8+T细胞的IFN-y和TNF-a分泌,以及CD8+T细胞的杀伤功能具有抑制作用。(3)PD-1在类风湿性关节炎患者体内的T细胞中表达降低,并与疾病进展相关。创新点及意义：本研究发现类风湿性关节炎患者外周血和关节滑液T细胞(包括CD4+T细胞和CD8+T细胞)上Tim-3表达显著升高,并利用统计分析发现Tim-3表达与类风湿性关节炎的疾病进展呈负相关,首次提出了Tim-3与类风湿性关节炎疾病发展的联系。本研究利用类风湿性关节炎患者外周血T细胞和Tim-3封闭抗体,证实Tim-3对患者内T细胞炎症具有抑制作用,首次提示有可能通过增强Tim-3功能来减弱类风湿性关节炎中的自身免疫反应,作为类风湿性关节炎治疗的新靶点,并首次检验了Tim-3封闭抗体在类风湿性关节炎患者体内能否有效阻截Tim-3在疾病T细胞中的信号传导机制,为今后利用Tim-3封闭抗体提供理论依据。本研究发现类风湿性关节炎患者外周血T细胞(包括CD4+T细胞和CD8+T细胞)上PD-1表达显著降低,并利用统计分析发现PD-1表达与类风湿性关节炎的疾病进展相关,首次提出了PD-1与类风湿性关节炎疾病发展的联系,提出PD-1表达有可能用于描述类风湿性关节炎疾病发展的指标之一,并提示有可能通过增强PD-1功能来作为类风湿性关节炎治疗的新靶点。