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研究背景及目的肺癌是世界范围内癌症致死的主要原因。肺腺癌(ADC)是肺癌的主要常见亚型。其中转移和侵袭是肺腺癌治疗中的巨大挑战。然而,基于转移和侵袭的分子机制是非常复杂的并且涉及多种分子和通路。肝X受体(LXRα/NR1H3和LXRβ/NR1H2)是一种核受体,它的作用是作为配体-激活的转录因子来调节脂代谢和炎症。LXR可以被天然配体羟基胆固醇类物质(如25羟基胆固醇和27羟基胆固醇)激活,也可以被合成的激活剂激活如T0901317(半数效应浓度为50nM)。25羟基胆固醇(25-HC)和27羟基胆固醇(27-HC)是两种羟基胆固醇类物质,是在多种组织器官中由胆固醇羟化酶催化而来的LXR配体。25-HC是一种有效的LXR介导的通路调节剂,参与体内脂质稳态、炎症和免疫反应。此外,25-HC还与肿瘤的发生发展有关,如抑制胶质母细胞瘤、乳腺癌、前列腺癌和前列腺癌异种移植物的细胞增殖。有研究表明,人体内基础水平的27-HC即能表现出显著的ER和LXR部分激动剂活性。除此之外,27-HC能够通过激活受体明显促进乳腺癌的转移,但是在黑色素瘤中,LXR的激活能抑制其转移。本实验旨在研究25-HC和27-HC是否影响肺腺癌细胞的迁移和侵袭,并探索其机制,为临床肺腺癌治疗提供新的依据。研究方法实验本研究中,我们使用人肺腺癌细胞系A549或NCL-H1975(上室)和人单核细胞THP1细胞(下室)创立了单培养和共培养系统检测羟基胆固醇对肺腺癌细胞迁移和侵袭的影响。为了排除羟基胆固醇对细胞增殖的影响,首先通过细胞增殖实来评估羟基胆羟基胆固醇对细胞增殖的影响,为迁移和侵袭实验选择合适的浓度。实验我们选择了0.1μM的25-HC、1μM的27-HC和50nM的T0901317用于接下来的实验。对于迁移实验,将ADC细胞种在6孔板中培养过夜,随后用无菌的200μL枪头在单层细胞上划出一条约1mm宽的线性划痕区。在单培养组中,分别向培养系统中加入上述各种药物;在共培养系统中,加入的上清来自已经用药物作用24小时的THP1分化的巨噬细胞。分别与0小时和24小时在相应位置拍照。对于侵袭实验,悬于无血清培养基中的ADC细胞加入上室,含有上述药物的完全培养基加入下室。根据说明书使用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测从单培养和共培养系统中收集的上清液细胞因子(IL-1β和TGF-β1)含量。最后,使用免疫印迹(Western blotting)分析检测蛋白LXR和Snail的表达量。结果1.在0.1μM浓度时,25-HC对细胞增殖没有影响,但是从浓度1μM到25μM,25-HC能抑制两种肺腺癌细胞的增殖,并且成剂量依赖性。对于27-HC,在0.1μM和1μM浓度时没有影响,但在10μM到50μM浓度时有促进作用。T0901317对于这两种肺腺癌细胞增殖均没有影响。2.在单培养系统中,羟基胆固醇(0.1μM的25-HC;1μM的27-HC)能够促进肺腺癌细胞迁移和侵袭过程。在共培养系统中,两种肺腺癌细胞的划痕愈合过程都显著加速。此外,LXR的激动剂T0901317与羟基胆固醇有相同的效应。3.ELISA结果显示,THP1分化的巨噬细胞在加入羟基胆固醇后减少了 IL-1β和TGF-β1的分泌。有趣的是,在巨噬细胞和ADC细胞共培养系统中,IL-1β的基础分泌量增加,加入羟基胆固醇后,对IL-1β释放产生促进作用。这与单培养组的趋势完全不同。3.加入羟基胆固醇后,单培养系统中的LXR和Snail表达量增加,此过程在共培养系统中更加明显。4.IL-1β能促进两种ADC细胞的迁移和侵袭,还能上调蛋白Snail的表达,但对LXR没有影响。5.敲除LXR之后显著抑制两种培养系统中25HC介导的Snail表达,但对IL-1β介导的Snail表达没有作用。6.敲除LXR后阻断了 25HC引起的ADC细胞迁移和侵袭,但不影响IL-1β诱导的ADC细胞的迁移和侵袭。结论在这次研究中,我们发现25-HC在0.1μM浓度时不影响肺腺癌细胞增殖;随着浓度升高,25HC抑制细胞增殖。除此之外,25HC还能够在不影响细胞增殖的情况下促进肺腺癌细胞的迁移和侵袭,尤其是在和THP-1分化的巨噬细胞共培养体系中表现更加明显。与此同时,25HC的受体LXR的表达量也相应提高。在敲除LXR之后,25HC对ADC细胞的迁移和侵袭不再产生促进效应,且Snail的表达量也不再升高。以此可得出结论:25HC可以通过激活LXR的方式促进肺腺癌转移。我们还发现,25HC都能够在共培养系统中显著地刺激IL-1β的分泌,并能增加肿瘤转移标志性蛋白Snail的表达。进一步研究发现,IL-1β模拟了 25HC对ADC细胞迁移和侵袭以及Snail蛋白表达的促进作用,敲除LXR后,25HC的这种促进效应被阻断,但IL-1β的促进作用没有受到影响,我们的这些研究结果表明,25-HC在单一培养中是依赖LXR促进ADC细胞迁移和侵袭的,共培养体系中25-HC诱导的IL-1β分泌能以不依赖LXR的方式加速ADC细胞迁移和侵袭。27HC的作用结果显示,浓度小于1μM时,27HC不影响ADC细胞增殖,随着浓度增加,产生了与25HC相反的效果,即促进细胞增殖。LXR的激动剂T0901317在50nM到10μM浓度范围内对癌细胞增殖没有影响。在不影响细胞增殖的情况下,27HC、T0901317均促进了 ADC细胞迁移和侵袭,上调蛋白Snail和LXR的表达,促进共培养组IL-1β的分泌,与25HC的结果相一致。