酮病是围产期奶牛常见的一种营养代谢病,主要是由奶牛能量摄取不能满足能量消耗所导致能量负平衡（NEB）引起,其主要病理特征为高酮血症和高非酯化脂肪酸（NEFA）血症。高浓度的NEFA和酮体能对肝脏产生脂毒性,促进脂质沉积,进而诱发肝脏病理损伤。反过来,肝损伤能进一步诱导肝脂沉积,使得两者之间形成恶性循环,最终加速奶牛酮病的发生。因此,肝脂沉积是使奶牛酮病复杂化的关键病理过程之一。自噬和内质网应激（ERS）是两个维持细胞脂代谢稳态的重要生物过程。在人和小鼠的研究表明,自噬损伤和ERS均能导致肝脏脂质蓄积。本实验室前期研究显示,围产期奶牛存在肝脏自噬体降解受阻和ERS,但这是否暗示自噬和ERS介导了围产期临床酮病奶牛的肝脂沉积并不清楚。因此,本研究旨在探究临床酮病奶牛肝组织细胞自噬和ERS的变化状态及其调节肝脏脂质沉积的内在机制。本研究收集临床酮病奶牛和健康奶牛血液及肝组织样本,检测临床酮病奶牛肝脏脂质沉积、细胞自噬和ERS状态。与健康奶牛相比,临床酮病奶牛表现为肝脏脂质蓄积和甘油三酯（TG）含量增加,脂合成相关转录因子（固醇调节元件结合蛋白-1c（SREBP-1c）、脂肪酸合成酶（FASN）和二酰基甘油酰基转移酶1（DGAT1））表达增加,脂氧化相关转录因子（过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）、肉毒碱棕榈酰转移酶1（CPT1）和肉毒碱棕榈酰转移酶2（CPT2））表达降低。更重要的是,临床酮病奶牛肝脏泛素结合蛋白（SQSTM1,又称p62）和微管相关蛋白1轻链3（MAP1LC3,又称LC3）的m RNA表达水平显著降低,而p62和LC3II的蛋白表达水平则显著增加。同时,还发现临床酮病奶牛肝脏中存在显著高表达的ERS伴侣分子葡萄糖调节蛋白78（GRP78）和剪接型X盒结合蛋白（s XBP1）m RNA水平及其相关的三条ERS信号通路（蛋白激酶RNA样内质网激酶（PERK）、肌醇需要酶1α（IRE1α）和激活转录因子6（ATF6））的激活。这些数据表明,临床酮病奶牛肝脏存在脂质蓄积,自噬受损和ERS激活。高浓度NEFA是临床酮病奶牛肝脏病理变化的主要诱发因素。本研究选择不同浓度NEFA（0、0.3、0.6和1.2 m M）处理奶牛原代肝细胞检测其对肝细胞自噬、ERS和脂质沉积的影响,并通过添加自噬抑制剂氯喹（CQ）和巴弗洛霉素A1（Baf A1）探究其内在机制。结果显示,NEFA处理显著增加犊牛原代肝细胞p62和LC3II的蛋白表达水平,促进PERK和IRE1α的磷酸化以及ATF6的剪切,并显著上调GRP78和s XBP1的m RNA水平。同时,NEFA处理还能显著增加SREBP-1c、FASN、DGAT1的基因表达水平,降低PPARα、CPT1和CPT2的基因表达水平,进而诱导肝细胞中脂滴和TG含量增加。重要的是,与对照组相比,CQ和Baf A1处理显著增加脂合成基因SREBP-1c、FASN、DGAT1的表达并显著降低脂氧化基因PPARα、CPT1和CPT2的表达,导致肝细胞的脂质蓄积。值得注意的是,这个过程伴随着ERS的过度激活。这些结果表明NEFA诱导的脂质蓄积是由自噬损伤和ERS激活介导的。为了进一步验证这一结论,本研究接下来使用自噬激活剂雷帕霉素（Rap）和GRP78过表达质粒处理奶牛原代肝细胞。结果发现,Rap下调GRP78和s XBP1的基因表达并降低PERK和IRE1α的磷酸化和ATF6剪切,进而缓解NEFA诱导的ERS。此外,Rap添加还降低脂合成基因SREBP-1c、FASN、DGAT1的表达,增加脂氧化基因PPARα、CPT1和CPT2的表达,缓解高浓度NEFA诱导的肝细胞脂滴和TG含量增多。更重要的是,无论是在CQ还是在NEFA处理时,过表达GRP78均能降低脂合成基因SREBP-1c、FASN、DGAT1的表达,增加脂氧化基因PPARα、CPT1和CPT2的表达,并缓解肝细胞中脂滴数量和TG含量的升高。以上结果表明,自噬受损引起的ERS介导了NEFA诱导的肝细胞脂质沉积。综上所述,临床酮病奶牛血液中高浓度NEFA损伤肝细胞自噬,激活ERS,进而促进脂合成,抑制脂氧化,导致临床酮病奶牛肝脂沉积。