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研究背景:急性心肌梗死是持续性心肌缺血和缺氧的严重急症。晚期糖基化终产物受体（receptor for advanced glycation end products,RAGE）在急性心肌梗死时表达水平增加,阻断RAGE蛋白表达可减轻心肌损伤。目前,许多研究通过病毒或脂质体携带小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）抑制rage的表达。然而,病毒具有细胞毒性、免疫原性、诱发炎症和基因突变等缺点,而脂质体囊泡包封效率较低,储存稳定性差,从血液中清除速度快,物理化学性质不稳定。作为一种可降解的多糖,壳聚糖（chitosan,CS）具有低毒性、低免疫原性、良好生物相容性、从血液中清除速度较缓慢和物理化学性质稳定等特点。CS/siRNA纳米颗粒转染可能成为一种高效、低细胞毒性的基因治疗方法。研究目的:（1）在细胞水平探索CS/siRNA纳米颗粒转染Sprague-Dawley（SD）大鼠原代心肌细胞的优化条件;（2）明确CS/siRNA纳米颗粒对原代心肌细胞的毒性作用;（3）探讨CS/靶向rage siRNA对缺氧条件下SD大鼠原代心肌细胞rage表达和细胞活性的影响,为今后CS/siRNA在心肌缺血缺氧动物模型的研究和临床相关心血管疾病药物治疗提供参考。研究方法:（1）CS/siRNA纳米颗粒的制作:以pH为5.5的醋酸-醋酸钠缓冲液溶解CS颗粒,得到1mg/ml的CS溶液,将20μL的100μmol/L siRNA溶液加入1ml CS溶液中,使用磁力搅拌器震荡2-3min,即得到CS/siRNA纳米颗粒,应用粒度仪检测CS/siRNA的粒径分布和Zeta电位;（2）1-3天SD大鼠幼鼠原代心肌细胞的分离和培养:取出12只1-3天SD大鼠幼鼠心脏,使用PBS清洗幼鼠心脏中的血液,以眼科剪去除可见的心房和血管组织,仅保留心室组织,使用眼科剪将心室组织剪碎成1-2mm~3大小的均匀小块,于0.25%胰蛋白酶消化后收集原代心肌细胞,使用细胞完全培养基稀释得20ml细胞悬液,接种于75培养瓶,培养100min后收集未贴壁细胞种板;（3）CS/siRNA纳米颗粒转染原代心肌细胞方法:使用不同浓度CS/siRNA于37℃和21%氧浓度条件下对原代心肌细胞进行转染;（4）CS/siRNA纳米颗粒最佳孵育时间确定:实验分为12h孵育组和24h孵育组,各组分别与不同浓度的CS/siRNA孵育,应用活细胞成像系统和CCK8法分别检测各浓度组CS/siRNA转染心肌细胞情况和对心肌细胞活性的影响;（5）CS/cy5-NC-siRNA纳米颗粒最佳转染效率的确定:选择12h孵育组,各组分别与不同浓度的CS/cy5-NC-siRNA孵育,分别应用活细胞成像系统和激光共聚焦显微镜检测CS/cy5-NC-siRNA转染效率;（6）心肌细胞缺氧模型的制作:将预备缺氧的原代心肌细胞换用无糖细胞完全培养基,而后将细胞培养板放于三气培养箱中于3%氧条件下缺氧不同时间;（7）心肌细胞活性测定:缺氧培养组分别转染不同浓度的CS/NC-siRNA(终浓度为0mg/ml,20*10-3mg/ml和24*10-3mg/ml),应用CCK8法检测3%氧浓度条件下缺氧不同时间的原代心肌细胞活性;（8）rage基因的表达抑制:缺氧培养组分别转染不同浓度的CS/靶向rage siRNA(终浓度为0mg/ml,20*10-3mg/ml和24*10-3mg/ml),应用q PCR技术检测各组原代心肌细胞rage的m RNA表达水平,应用Western blot方法检测各组原代心肌细胞rage的RAGE蛋白表达水平,应用CCK8法检测孵育后各组心肌细胞活性。研究结果:（1）经磁力搅拌器震荡后所获得的CS/siRNA纳米颗粒氮磷比为70:1,应用粒度仪检测CS/siRNA粒径为370.50nm,Zeta电位为28.17m V。（2）活细胞成像系统检测表明,与24h孵育组相比,12h孵育组心肌细胞有较清晰而更加完整的心肌细胞形态,心肌细胞核的位置也更加明显,处于细胞分裂状态的心肌细胞更加明显可见。（3）12h孵育组中0mg/ml组细胞活性与其他浓度组相比无明显统计学差异（P>0.05）,24h孵育组中0mg/ml组细胞活性高于其他浓度组（P0.05）,但明显高于其他浓度组（P0.05）。（6）于3%氧浓度下培养2h,4h和6h的0mg/ml组、20*10-3mg/ml组和24*10-3mg/ml组的细胞活性与正常培养组相比无明显统计学差异（P>0.05）,于3%氧浓度条件下培养8h的0mg/ml组、20*10-3mg/ml组和24*10-3mg/ml组的细胞活性与正常培养组相比下降（P<0.05）。（7）与正常培养组[m RNA水平（1.0000±0.0681）和RAGE蛋白水平（0.8236±0.0374）]相比,缺氧心肌细胞0mg/ml组rage表达的m RNA水平（4.0623±0.2230）和RAGE蛋白水平（1.2115±0.1013）明显升高（P<0.0001）,缺氧心肌细胞20*10-3mg/ml组[m RNA水平（0.0492±0.0050）和RAGE蛋白水平（0.4227±0.1031）]和24*10-3mg/ml组[m RNA水平（0.0408±0.0086）和RAGE蛋白水平（0.1692±0.0261）]的rage表达的m RNA和RAGE蛋白水平明显减少（P<0.0001）。（8）缺氧心肌细胞0mg/ml组细胞活性（0.7756±0.0325）与正常培养组细胞活性（0.9747±0.0997）相比明显下降（P0.05）。研究结论:（1）氮磷比为70:1的CS/siRNA能有效转染原代心肌细胞,20*10-3mg/ml和24*10-3mg/ml的CS/siRNA浓度与12h的孵育时间能有效转染,同时减少细胞毒性;（2）CS/靶向rage siRNA转染原代心肌细胞能有效抑制RAGE蛋白的表达;（3）抑制心肌细胞RAGE蛋白的表达能有效减轻缺氧所致的心肌细胞活性损害,本实验结果为开发心肌梗死后心肌重构的基因治疗方法提供一定的理论基础。