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1、背景:乙型链球菌制剂在临床上的应用也表明有明显的抗瘤和提高免疫力作用。早在1967年日本学者Okamoto的研究证明:链球菌的抗肿瘤活性主要是由该菌产生的S溶血素所致,并证明溶血性链球菌对多种移植性动物肿瘤均有杀伤作用,包括艾氏腹水癌、S180、S37、Bron-pearce癌、Krebs-2癌、Yoshida腹水肉瘤、纤维瘤、淋巴性白血病（SN36、L4946）、腹水性肝癌（AH-130、AH-66）。与癌细胞接触,能直接破坏癌细胞RNA转录过程,使癌细胞膨胀空泡化及崩溃坏死。此外还能启动细胞及体液免疫,使肿瘤坏死因子、干扰素、白介素等细胞因子水平显著提高,从而包围浸润和附着在肿瘤细胞上,使之变性坏死,癌细胞减少,从而控制肿瘤生长。因此,溶血性链球菌制剂通过直接杀伤肿瘤细胞和激活机体免疫系统非特异性杀伤肿瘤细胞,既是抗肿瘤药物也可以免疫调节剂。根据该原理研制并生产OK-432β-溶血性链球菌抗肿瘤生物制剂。该药在日本已广泛用于肿瘤的辅助治疗,是一种细菌免疫强诱导剂,溶血性链球菌高效低毒菌株SIPI722经青霉素等处理后制成的冻干粉针剂。我国同类制剂（商品名:沙培林）也在肿瘤临床广泛使用,近十多年来,我国载人航天科技发展迅猛,使得运用载人航天飞船的空间技术条件进行微生物太空诱变（Space Mutation）育种是培育生物新菌种成为现实。其原理是通过外层空间特殊的物理化学环境,即微重力、宇宙辐射、高能粒子、交变磁场及超洁净等环境中,引起菌种DNA分子的变异和重组,菌种遗传性状发生改变,从而获得生命力旺盛、生长速度快、代谢产物获得率高、品质优良并可稳定遗传的高产高效菌种。将溶血链球菌D33#连续多次搭载“神舟”系列飞船和返回式科学与技术实验卫星,使之邀游太空实现了诱变,最终获得高产高效、有自主知识产权的创新型菌株溶血链球菌T33#。注射用多抗甲素（甘露聚糖肽）在我国临床已经广泛应用于抗肿瘤治疗疗效显著。该药为溶血性链球菌33#菌株绎深层提炼而成的其免疫活性的a-甘露聚糖肽类物质,对S180肉瘤有抑制作用,抑小鼠艾氏腹水癌DNA合成,增加小鼠腹网状内皮系统的吞噬能力及淋巴细胞转化功能,促胸腺淋巴细胞代谢,拮抗CTX对机体的免疫抑制作用。用免疫增强剂。具有增强机体免疫功能和激活吞噬细胞、升高外周白细胞的作用;能提高骨髓造血机能和机体应激能力。众所周知,生物细胞及血液中存在糖复合物。糖链是继蛋白质、核酸之后的第三条生命链。复合物作为一类生物性物质,广泛存在于人体内,愈来愈多的研究表明,糖复合物是体内重要的信息分子,在细胞的分化、信号的传导、分子的识别等许多生命活动中起着十分重要的作用。糖复合物中的寡链是分子间及细胞间识别的标志。通过这种识别作用,许许多多的生物反应被启动了。在正常情况下,各种糖链表达的水平是相对稳定的。当细胞出现恶变,糖链的性质及数量都会发生一系列变化,并可以反映在于凝集素的结合能力上。凝集素（Lectin）是指一种从各种植物,无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白,因其能凝集红血球（含血型物质）,故名凝集素。凝集素是一类天然的免疫原性、能识别糖链结构的蛋白质,其与糖表现出专一性的结合,类似抗原抗体特异性结合。利用凝集素的这种天然特性,可将其作为探针检测肿瘤细胞表面、细胞内和血清中多糖水平。糖在目前的临床诊疗当中有着重要的作用。根据凝集素与糖的这个特异性结合,可以将其分为7大类:（1）D—甘露糖（D---葡萄糖）组;（2）N---乙酰葡萄糖胺组;（3）乙酰半乳糖胺组;（4）D---半乳糖组;（5）L---岩澡糖组;（6）唾液酸组;（7）复合糖组。各类凝集素相关多糖分子和肿瘤的发病及诊疗均有较密切的关系。当肿瘤出现时,糖复合物与凝集素结合会发生改变,而且肿瘤细胞伴有细胞膜的改变,细胞膜上的糖基也会产生相应的变化,可用凝集素检测出来。大量研究发现,凝集素可作为肿瘤组织源性的标记、肿瘤特异性诊断的标志、肿瘤恶性的标记和不同肿瘤的分化标记。2、目的:在不同种类的凝集素中选取五种有代表性的凝集素,分别是刀豆凝集素（ConA）、麦胚凝集素（WGA）、接骨木凝集素（SNA）、蓖麻凝集素Ⅰ（RCAⅠ）、植物血凝（PHA）。利用凝集素与糖特异性结合的特性研究注射链球菌制剂对S180荷瘤小鼠肿瘤细胞N-高甘露糖型、末端GlcNAc、末端Neu5Aca2-6Gal、末端Galβ1-4GlcNAc及Gal-NAC多糖分子表达变化的情况;观察经序贯注射后肿瘤生长情况;探讨链球菌制剂抑瘤率与糖链表达水平的关系。3、方法:3.1、建立动物模型:随机分成4组,①②③④每组10只。1)先将①②组小鼠进行全身免疫,方法:腹腔内注射链球菌制剂（注射剂量均为0.1mg）。而③④组则腹腔内注射生理盐水;2)约一周后将4组小鼠均予皮下接种S180肉瘤细胞,约两周后长出直径约1cm的肿瘤;3)取出组①（腹腔注射链球菌制剂2组其中1组）以及组③（腹腔注射生理盐水2组的其中1组）,在瘤内直接注射相同剂量的链球菌制剂,剩余2组②④注射生理盐水。经上述处理一周后,将小鼠处死取出肿瘤组织,分离出单个细胞悬液,用PBS缓冲溶液将其调整成相同浓度100毫克/ml,予超声波破碎肿瘤细胞,取其上清液。收集后于-70℃存放,待检。3.2、带辣根过氧化物酶标记的凝集素制备:通过改良过典酸钠法将两者偶联。检查酶标凝集素结合率及效价。3.3、样品收集及处理:S180肉瘤细胞样品行超声破碎,反复冻融后,在超声破碎仪破碎。按超声说明,将肉瘤细胞和PBS混合,并把浓度调整到每个样品为100毫克/ml（通过显微镜检,细胞数大约为7×108个/ml）功率:800W,总时间:4分钟/样品,破碎时间:2分钟（开5秒,关5秒）。根据公式:细胞相对破碎率=（1-超声后细胞沉淀湿重/超声前细胞沉淀湿重）%,计算出破碎率达98.7%。取上清液,离心20min（12000r/s）,得澄清液在-20℃冰箱保存待测。3.4、凝集素识别多糖分子的检测:将样品按以上的最适宜浓度包被96孔ELISA板上,每孔100μl,4℃过夜,PBS缓冲液洗1次,分别加入检血清100μl,4℃反应4h,PBS洗3次,加入辣根过氧化物酶标记的糖蛋白,每孔100μl,4℃反应4h,PBS洗3次,TMB2H2O2显色10min,中止反应后,用酶联免疫检测仪检测波长450nm OD的值。计算抑瘤率:[模型组瘤重-实验组瘤重】/模型组瘤重。3.5、实验对照:取破碎小鼠红细胞的上清液代替待测样品作阳性对照:用PBS代替检测血清做阴性对照;其他步骤不变。3.6、统计学数据经SPSS13.0统计软件处理。4、结果4.1、计算抑瘤率计算联合给药治疗组、全身给药治疗组、局部给药治疗组的抑瘤率分别:35.1%、8.8%、19.9%。结果提示:联合给药组较全身给药组及局部给药组的抗瘤效应显著。4.2、制备ConA-HRP/WAG-HRP/SNA-HRP/PHA-HRP/RCA1-HRP。标记率分别为0.73、0.78、0.75、0.70、0.71。以ELISA法检测效价均为1:1000。4.3、各种小鼠肿瘤细胞ConA/WAG/SNA/PHA/RCA-1识别的相关多糖分子含量OD值:联合给药治疗组样品ConA/WAG/SNA/PHA/RCA-1识别的多糖分子含量OD值分别:1.306±0.020、1.313±0.033、1.259±0.031、1.255±0.021、1.251±0.028全身给药组治疗分别:1.856±0.025、1.737±0.033、1.444±0.028、1.669±0.035、1.566±0.035局部给药组治疗分别:1.362±0.024、1.384±0.033、1.386±0.025、1.346±0.033、1.417±0.031阴性对照组分别:1.952±0.024、1.764±0.032、1.534±0.025、1.802±0.034、1 689±0.030以上结果输入SPSS13.0作析因分析,（腹腔内注射及瘤内注射）主效应均有显著统计学差异A腹腔注射链球菌P=0.000;B瘤内注射链球菌P=0.000,可以认为腹腔内注射链球菌及瘤内注射链球菌均能使ConA/WAG/SNA/PHA/RCA-1相关多糖分子表达含量降低;五种相关多糖两因素有交互作用,腹腔内及瘤内均注射（序贯给药）太空链球菌时,ConA/WAG/SNA/PHA/RCA-1相关多糖分子表达含量降低最显著。5、结论:5.1、先全身给药后局部给药的序贯给药治疗方法对小鼠S180肉瘤的生长的影响经析因分析两因素有交互效应,腹腔内注射免疫小鼠对瘤内注射有增效作用,表明S180荷瘤小鼠的序贯免疫注射太空链球菌制剂较仅瘤内注射的抑瘤效果显著。提示太空链球菌制剂既有抗瘤作用。为临床肿瘤治疗研究提供参考。5.2、先全身给药后局部给药的序贯给药治疗方法对多糖分子表达水平的影响经析因分析后也存在交互效应,S180荷瘤小鼠经序贯注射太空链球菌制剂后肉瘤细胞的ConA/WAG/SNA/PHA/RCA-1相关的多糖分子含量均明显下降。表明多糖分子整体表达水平下调,肿瘤糖基化程度降低。