细菌纤维素/金属杂化纳米酶复合材料的构建及抗菌应用研究

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细菌等病原微生物感染严重威胁人类健康,给临床治疗、伤口护理带来巨大挑战。针对复杂的细菌感染疾病,研发具有针对性抗菌作用以及多功能的新型抗菌医用材料具有十分重要的应用价值。纳米酶因具有天然酶的生物催化效果,近年来被广泛应用于医学治疗中。纳米酶显示高效的催化速率和稳定性,能够快速催化一些小分子物质产生具有抗菌效果的活性氧分子(reactive oxygen species,ROS),通过ROS对细菌各组分的氧化破坏作用能够使细菌失活,避免耐药性细菌的产生。其纳米尺寸效应有助于靶向作用于细菌感染部位,从而减少对健康组织的毒副作用。并且,通过表面修饰、形貌结构调控等方法可构筑具有特异性催化效果及多功能化的纳米酶,因此纳米酶在抗菌治疗领域展现巨大的应用前景。为满足临床抗菌治疗的多样化需求,本论文选用具有优异生物应用性能的细菌纤维素(bacterial cellulose,BC)为基材,通过设计具有特异性催化效果的金属杂化纳米酶与细菌纤维素复合,制备了具有催化抗菌效果的温敏性可注射纳米凝胶、止血水凝胶、复合伤口敷料以及兼具生物检测功效的纳米纤维传感器,赋予所制备材料治疗、修复及诊断功能以满足临床抗菌治疗个性化与多样性需求,为开发应对体内外细菌感染多种应用需求的抗菌医用材料以及拓展纳米酶在催化抗菌领域的应用提供了多种设计思路。本论文的研究工作如下:(1)针对不易给药部位的细菌感染治疗,设计了具有催化抗菌性能的温敏可注射复合纳米凝胶。首先制备了铜离子掺杂的碳纳米片Cu-SA,Cu-SA具有过氧化物酶(peroxidase,POD)催化活性,在酸性条件下通过Fenton反应能够有效催化低浓度的H2O2分解产生具有高抗菌活性的羟基自由基(·OH)。进一步以细菌纤维素纳米晶须为增强材料和Cu-SA载体,通过共混的方式与温敏性聚合物聚-N异丙基丙烯酰胺复合,制备了具有温敏效果的复合纳米凝胶Cu-SA@BCNW/PNI。该纳米凝胶在33.4℃能够快速发生溶胶-凝胶相转变,并且表现良好的形状稳定性和持水能力。此外,所制备碳纳米片催化剂以及复合纳米凝胶显示良好的细胞相容性以及血液相容性。抗菌结果表明在1 m M H2O2的存在下,Cu-SA@BCNW/PNI可在3小时内灭活全部的金黄色葡萄球菌(6.36 log)及大肠杆菌(6.01 log),显示优异的催化抗菌效果。该凝胶可通过注射器将纳米凝胶前驱体溶液注射到感染部位,随着温度的改变其能够快速原位变为凝胶,同时可以催化生物体内低浓度的H2O2分解产生强氧化性的·OH使细菌灭活,提供了一种便携的细菌感染治疗方案。(2)为了提升模拟过氧化物酶(peroxidase-like nanozymes,POD-like酶)的适用范围,改善其催化性能受到p H值限制的缺点,通过表面修饰的方法在具有POD催化性能的金属有机骨架(metal-organic framework,MOF)纳米颗粒表面负载葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GOx),制备了一种具有自激活催化抗菌功效的复合纳米酶Cu@ZIF/GOx。负载的GOx能够催化葡萄糖分解产生H2O2以及葡萄糖酸,葡萄糖酸可以有效降低反应体系的p H值进而引发Cu@ZIF将生成的H2O2转化为高抗菌活性的·OH。进一步将Cu@ZIF/GOx与细菌纤维素纳米纤维以及瓜尔豆胶复合,制备了一种具有葡萄糖响应催化性能的水凝胶敷料BC/GG-Cu@ZIF/GOx。体外凝血测试表明通过对血液的吸收作用,该水凝胶能够有效促进红细胞和血小板的聚集,引发血纤蛋白的形成,进而促进凝血;体内止血测试结果显示该水凝胶应用于出血伤口上可以在短时间内实现伤口处的止血。同时,被吸收血液中的葡萄糖通过水凝胶中Cu@ZIF/GOx的催化作用可以被转化为·OH使细菌灭活,从而实现抗菌及止血协同治疗效果。抗菌结果表明,所制备复合水凝胶的催化抗菌效果随葡萄糖浓度(0-10 m M)的升高而增强,在10 m M葡萄糖存在下,可使4.13 log的金黄色葡萄球菌(总量6.33 log)以及4.94 log的大肠杆菌(总量6.44 log)灭活,表明其不但适用于普通出血伤口细菌感染治疗,同时在糖尿病患者伤口感染治疗中展现较大的应用价值。(3)POD-like/GOx复合纳米酶掺杂的水凝胶敷料能够通过自激活的级联催化反应将葡萄糖转化为高抗菌活性的·OH,但由于水凝胶内部的复合纳米酶难以发挥其催化作用而影响催化抗菌速率。为了得到具有更高催化抗菌效果以及更加便携包扎使用的抗菌治疗材料,设计了一种具有葡萄糖响应催化功能的BC/无纺布复合伤口敷料。首先制备了具有中空纳米球结构的POD-like酶Fe@HCMS,通过进一步负载GOx得到复合纳米催化剂Fe@HCMS/GOx。其超高比表面积有利于更快速地催化伤口渗出液及血液中存在的葡萄糖产生·OH用于细菌灭活,同时可以抑制细菌借助于葡萄糖养分增殖造成严重感染。进一步通过细菌生物合成的方法在丙纶无纺布上生长BC,并将其作为纳米催化剂载体,制备了BC/PP-Fe@HCMS/GOx复合伤口敷料。基于BC优异的亲水性,得到的复合伤口敷料的吸水率高达900%,并且显示优异的透气性。借助于Fe@HCMS/GOx的级联催化反应,抗菌结果表明所制备复合伤口敷料在正常生理水平血糖范围以及高糖水平下抗菌效果均十分显著,同时能够抑制细菌生物膜的形成。此外,小鼠伤口感染实验及组织病理学分析结果显示该伤口敷料不但对伤口处的细菌表现显著的抗菌效果,同时能够减轻伤口处的炎症反应,并促进新的成纤维细胞以及表皮组织层的生成,对细菌感染伤口显示明显的促愈合效果,在细菌感染伤口治疗及修复中展现巨大的应用价值。(4)基于POD-like酶对H2O2的催化特性,为了开发具有更广p H值应用范围的抗菌催化剂以及拓展其在H2O2比色检测上的应用,以细菌纤维素为基底,通过在细菌纤维素纳米纤维上生长铜掺杂的酚醛聚合物,进一步经高温碳化,制备了一种具有双重酶催化性能的碳纳米纤维BC/RF@Cu。BC/RF@Cu同时表现POD以及卤代过氧化物酶(haloperoxidase,HPO)催化性能。基于其双重酶催化效果,选用3,3’,5,5’-四甲基联苯胺以及苯酚红为显色底物,构建了适用于酸性、中性以及碱性条件下对H2O2的比色检测方法,结果显示BC/RF@Cu在p H值范围在3-5及7-9内均表现对H2O2检测的灵敏性,酸性条件下检测限为2.22μM,碱性条件下检测限为3.40μM。此外,基于BC/RF@Cu的双重酶催化效果,其可在不同p H值下有效催化H2O2产生·OH以及在H2O2存在下催化Br-形成Br+,对金黄色葡萄球菌以及大肠杆菌表现出良好的抗菌效果,并且能够有效消除细菌生物膜。该碳纳米纤维催化剂既可以实现对H2O2的比色检测,也能够实现催化H2O2用于抗菌的效果,解决了目前纳米酶生物传感器对H2O2检测灵敏性以及催化抗菌效果受p H限制的缺点,为纳米酶在生物传感以及医学治疗多功能化应用中提供了新的设计思路。
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