研究背景和目的蛋白尿是肾小球疾病中重要的临床表现,其发生主要由于肾小球滤过屏障受损。肾小球的脏层上皮细胞(即足细胞)在滤过屏障组成起着重要作用,它通过保持足突形状互相交错并形成裂孔隔膜成为最后一道滤过屏障。足细胞是一种终末分化细胞型,具有高度专业和极化,因此它不能增殖和分裂。众所周知,足细胞的凋亡和或从肾小球基底膜分离是蛋白尿的发生和进展至终末期肾病的重要机制。然而,对于导致或促进足细胞凋亡的分子机制仍然了解有限。线粒体是重要的细胞器,它通过产生和传递三磷酸腺苷(ATP)确保能量供应。并且它在某些细胞活动中也起其中重要作用,如离子平衡、活性氧(ROS)的产生、细胞死亡/凋亡。研究显示许多类型的肾脏疾病都涉及线粒体功能障碍和ROS过多产生。据报道有线粒体变性尤其有基因突变的许多患者发展成局灶节段性肾小球硬化(FSGS)。嘌呤霉素(PA)诱导足细胞损伤的小鼠显示线粒体转录因子(mtTfa)和核呼吸因子-1(Nrf-1)的mRNA表达下降,线粒体DNA(mt DNA)复制数量减少,细胞色素c氧化酶I(CoxI)水平也下调。最近,在醛固酮诱导的足细胞损伤中可检测到PGC-1抑制、线粒体破坏和细胞凋亡,这些现象可被SIRT1催化剂通过增加PGC-1的表达来得到改善。在培养的小鼠足细胞中,转化生长因子-β1(ransforming growth factor-beta1,TGF-β1)通过ROS生成、线粒体功能障碍和细胞凋亡必需的TGF-β受体-Smad2/3信号通路诱导线粒体Nox4活性。不但来自实验细胞、动物模型而且来自人类的这些发现显示线粒体损害与足细胞受损和肾小球疾病密切相关。然而,潜在的分子机制仍未明确需进一步阐明。人微小病变的特征是大量蛋白尿和足突的消失,这可通过糖皮质激素治疗完全恢复。同样的,模拟人微小病变,在小鼠嘌呤霉素诱导的肾病中,足突和蛋白尿能自发恢复。因此,目前的研究旨在解决PA-诱导的足细胞损伤模型中与体内外线粒体功能障碍有关的潜在近端信号。我们的发现显示嘌呤霉素使Smad3/Nox4轴活化,从而诱导线粒体损害、ROS产生以及激活细胞色素c–caspase9–caspase3信号细胞凋亡途径导致足细胞损伤。研究方法和材料体外实验:小鼠足细胞MPC5(Peter M教授的友情赠送)在33°C含10%胎牛血清(Gibco)和10 U/ml的重组鼠γ-干扰素(Invitrogen)的RPMI1640介质中培养。在指定的时间段用PA(Sigma)刺激足细胞,建立嘌呤霉素致体外足细胞损伤模型。采用Annexin V-FITC和Propidium Iodide(PI)双染色凋亡检测试剂盒(BD Biosciences)进行足细胞凋亡检测。采用慢病毒载体shRNAs下调鼠Smad3,Nox4,Dab2的表达,以证实Smad3/Nox4信号通路在PAN诱导的足细胞损伤中的作用。用配有60油镜镜头的激光扫描共聚焦显微镜(Zeiss)拍片,运用ImageJ1.47软件量化内化的FITC-白蛋白强度,用490nm的荧光多井板阅读器(PerSeptive Biosystems)测定FITC-白蛋白吸收率来显示单层足细胞的滤过/流入功能,从而评价足细胞对白蛋白的摄取和流入功能。体内实验:一次性腹腔注射PA(Sigma)10 mg/100g建立嘌呤霉素肾病(PAN)大鼠模型,对照组注射等量生理盐水。从注射PA的第二天起,每日一次胃饲强的松0.6mg/100g,酶联免疫吸附法测定尿蛋白和肌酐,证实强的松可改善PAN大鼠线粒体功能。用耗氧率(OCR)检测试剂盒(Cayman Chemical Company)来分析细胞耗氧水平,通过JC-1染料评估线粒体膜电位(MMP)水平,使用DCFDA Cellular ROS Detection Kit(Abcam)检测ROS产生,用Microplate Assay Kit分析线粒体复合物I和IV的活性,观察体内外线粒体功能变化。Western blot检测caspase3、Smad3、Nox4、Cox I、Cox II、CoxIII、Cox IV、mtTfa、cyt-c、Dab2等相关信号通路中的变化。运用上述实验方法研究体内外嘌呤霉素诱导的足细胞损伤与线粒体功能障碍相关的潜在近端信号。统计学处理数据显示为均数±标准偏差(SD)。使用SPSS13.0软件进行分析统计,用单向或双向方差进行统计评价,P值<0.05被认为有统计学意义。研究结果1.嘌呤霉素诱导足细胞损伤。用不同浓度的嘌呤霉素处理已分化的足细胞,与对照组相比,凋亡细胞的百分比均显著增加,并呈现剂量依赖递增。另外观察到嘌呤霉素对足细胞凋亡作用呈时间依赖递增。与对照组相比,在使用嘌呤霉素的24小时和48小时后蛋白酶3活性显著增加,而且白蛋白流入实验也显示嘌呤霉素处理的足细胞内的FITC-白蛋白平均强度显著增加。2.嘌呤霉素诱导足细胞线粒体DNA的损伤。在使用嘌呤霉素12小时,显示mtDNA复制数在显著下降,在随后24小时和48小时呈继续下降趋势。嘌呤霉素诱导足细胞线粒体复合物I和IV的活性在12小时和24小时发生显著下降。在嘌呤霉素处理后,Cox III蛋白在任何时间点无变化,然而Cox I和Cox II水平在6小时到24小时中显著下降,Cox IV在12小时和24小时明显下降。在嘌呤霉素处理后12小时和24小时,mtTfa出现显著下降,Nrf-1在6小时出现下降,并在随后的12和24小时呈继续下降。在嘌呤霉素处理后6小时,线粒体片段中充裕的琥珀酸脱氢酶亚单位A(SDHA)和细胞色素C(cyt-c)呈显著减少,在随后12小时和24小时呈继续减少。3.嘌呤霉素诱导足细胞线粒体功能障碍。与0小时相比,在6小时、12小时、24小时嘌呤霉素诱发耗氧量水平减少呈显著的时间依赖。MMP相对水平在嘌呤霉素处理在6小时、12小时、24小时后也明显下降,并呈现时间依赖型。此外,用细胞渗透荧光染色DCFDA检测ROS产物。在嘌呤霉素处理12小时和24小时,ROS相对水平显著上升。在嘌呤霉素处理6小时,锰超氧歧化酶(MnSOD)和过氧化氢酶数量显著减少,在12小时和24小时呈持续下降。4.嘌呤霉素诱导足细胞p-Smad3核转移和线粒体Nox4上调。在嘌呤霉素处理12小时、24小时,线粒体片段内的Nox4蛋白含量显著上升。免疫印迹试验显示嘌呤霉素导致胞质片段内p-Smad3显著减少,但当12小时、24小时其在细胞核片段内呈显著增加,这意味嘌呤霉素诱导p-Smad3从胞质转移至核内。其次,本研究显示,在嘌呤霉素处理12小时、24小时,胞质片段内的cyt-c蛋白量显著增多,这与之前嘌呤霉素显著减少线粒体cyt-c水平相符合。这些数据证明PA可使cyt-c从线粒体释放至胞质。嘌呤霉素处理的足细胞在12小时、24小时,可观察到活化的caspase9和裂解的caspase8显著增多。5.Dab2参与嘌呤霉素诱导足细胞白蛋白内在化。免疫印迹试验揭示嘌呤霉素呈时间依赖提升Dab2表达。实验结果显示在嘌呤霉素处理足细胞核片段内p-Smad3的数量显著上升,但这不受Dab2敲低影响,这暗示Dab2可能不参与嘌呤霉素诱导的p-Smad3核转位。同样,Dab2敲低也不影响嘌呤霉素诱导的足细胞凋亡。嘌呤霉素处理的足细胞内FITC-白蛋白的强度显著增加,但可被Dab2敲低明显抑制,这表示Dab2可能与嘌呤霉素诱导的足细胞白蛋白细胞内吞有关。而且,在嘌呤霉素处理足细胞中,FITC-白蛋白和早期内标记EEA1的共区域明显增加,这可被Dab-shRNA有效的减少。这些数据表示在嘌呤霉素处理足细胞中,Dab2参与白蛋白细胞内吞作用,而与Smad3信号介导的细胞凋亡无关。6.敲低Smad3和Nox4可减弱嘌呤霉素诱导足细胞损伤作用。足细胞被Smad3-shRNA或Nox4-shRNA感染24小时,嘌呤霉素对Nox4诱导可被Smad3敲低显著抑制。然而在Nox4-shRNA表达的足细胞中,仍发生嘌呤霉素诱导的p-Smad3下调。这些发现暗示在嘌呤霉素致足细胞损伤中,Nox4可能是Smad3活性的下游信号。在PA处理的足细胞中,Smad3-shRNA或Nox4-shRNA部分抑制mtDNA和耗氧量水平的下降。并且在嘌呤霉素处理的足细胞中,MMP相对水平的下降也可部分被Smad3-shRN阻止,然而能完全被Nox4-shRNA阻止。在Smad3-shRNA或Nox4-shRNA表达的细胞中,嘌呤霉素诱导的ROS产生明显下降。而且,在嘌呤霉素处理的足细胞中细胞凋亡的百分比显著增加,也可被Smad3-shRNA和Nox4-shRNA阻止。此外,在有Smad3-shRNA或Nox4-shRNA表达的足细胞中,经PA处理的细胞质中活化的caspase3和cyt-c的减少可完全被阻止。我们的结果强烈表明Smad3–Nox4信号途径的活化介导嘌呤霉素致足细胞损害。7.嘌呤霉素肾病大鼠发生线粒体损害。在注射嘌呤霉素后,大鼠在第3天出现显著蛋白尿,在第10天出现高峰,在第15天出现下降。定量分析显示注射嘌呤霉素后,肾小球mtDNA水平在第3天显著下降,并在第10天持续下降。但是,在第15天mtDNA水平部分恢复。这结果显示嘌呤霉素也可导致体内线粒体DNA损害。在嘌呤霉素肾病大鼠中,MMP相对水平在第10天显著下降,在第15天部分恢复。此外,注射嘌呤霉素后线粒体复合物I酶活性和复合物IV酶活性在第10天明显减弱,在第15天部分恢复。在嘌呤霉素肾病大鼠的线粒体片段内,免疫印迹分析显示CoxI和mtTfa水平在第3天下降,并在第10天继续下降,在第15天部分恢复,更加表明嘌呤霉素肾病大鼠发生线粒体DNA损害。与体外发现相一致。Nox4水平在第3天显著升高,在第10天达高峰,然后在第15天部分恢复。在胞质部分,cyt-c和caspase3水平在第3天显著上升,在第10天达高峰,然后在第15天部分恢复,这表示嘌呤霉素通过线粒体释放cyt-c活化caspase3导致足细胞凋亡。8.强的松改善嘌呤霉素肾病大鼠的线粒体功能。通过强的松处理,嘌呤霉素注射导致的蛋白尿显著减少。并且,JC-1试验显示PA注射致MMP水平下降可被强的松明显抑制。同样,在嘌呤霉素肾病大鼠中,强的松也显著阻止mtDNA水平的降低。此外,在接受强的松治疗的嘌呤霉素肾病大鼠中,相应的线粒体Nox4和p-Smad3的核转位显著减弱。结论1.嘌呤霉素诱导足细胞损伤呈时间和剂量依赖性。2.体内外嘌呤霉素诱导的足细胞损伤模型均发生线粒体DNA损伤和功能障碍。3.Smad3/Nox4信号介导线粒体功能障碍,并通过增加ROS产生和激活cyt-c–caspase9–caspase3细胞凋亡途径参与嘌呤霉素诱导的足细胞损伤。4.Dab2介导的内吞作用可能增加了受损足细胞的通透性。