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研究背景：急性心肌梗死（AMI）是冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死，在欧美最常见，美国每年约有150万人发生心肌梗死；而近年来在我国呈明显上升趋势，每年新发至少50万，现患病人数至少200万，严重影响了人民群众的生活质量。心肌梗死发生后，梗死区域的心肌细胞(CMs)因为缺血的损伤而失去了收缩功能，心脏的泵血功能也会严重受损。如果剩余的心肌细胞没有足够的时间进行重组，心力衰竭就会发生。近年来的研究发现，心脏c-kit+干细胞可以改善心脏功能，但是心脏中的这类细胞数量较少，不能完全阻止心力衰竭的发生。所以骨髓（BM）来源的c-kit+干细胞成为一个新的选择。这类干细胞可以迁移到心脏梗死区域并进行心肌修复已经有相关文献报道，而且经心肌注射或血管内注射骨髓c-kit+干细胞后可以修复梗死心肌也有相关临床试验取得了一定的进展。但是对于心肌梗死后骨髓中的c-kit+干细胞的动员及其机制尚不可知。本研究旨在利用分子生物学技术、细胞免疫学技术和统计学方法旨在探讨AMI后BM的单个核细胞（MNCs）里c-kit+干细胞的动员，小鼠骨髓中MNCs细胞的增殖水平及c-kit+干细胞的对称和不对称分裂在心肌损伤修复中的作用，为干细胞治疗提供新的思路和支持。研究目的及内容：1.采用PCR技术分析AMI后（术后第3、7天）骨髓中c-kit+干细胞的mRNA水平变化，并应用流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）、磁珠分选技术（MACS）、免疫荧光染色技术检测急性期（术后第2、3、7天三个时间点）的c-kit+干细胞的比例变化并直接观察c-kit+干细胞，以探索AMI后骨髓的c-kit+干细胞动员情况；2.应用免疫荧光染色及统计学方法检测骨髓单个核细胞（BM-MNCs）和细胞亚群（c-kit+和c-kit-细胞）中增殖相关蛋白ki67及PH3的表达水平，探讨AMI引起的c-kit+干细胞比例增加与骨髓活跃增殖状态的关系；3.应用Numb和alpha-adaptin分析AMI后BM-MNCs中不对称分裂模式并通过和乳鼠的BM-MNCs分裂模式的对比，以及c-kit+干细胞和c-kit-细胞亚群的增殖、分裂模式，探讨c-kit+干细胞的不对称分裂在损伤心肌修复中可能的作用。4.检测冠心病病人的骨髓c-kit+干细胞和c-kit-细胞的的不对称分裂现象和相对比例，探讨心肌缺血引起的人骨髓中c-kit+干细胞不对称分裂的增多。研究方法：应用8周-10周的野生型纯合子C57BL/6小鼠（体重22-25g），随机分组。心梗组于异氟烷气体麻醉后行胸廓切开术，随后将冠状动脉左前降支近段结扎，制作心肌梗死模型。对照组只穿线不结扎。术后选取2、3、7天时间点处死小鼠并获取骨髓单个核细胞。首先，应用RT-PCR、流式细胞术及磁珠分选术，分别检测并统计心肌梗死后骨髓中c-kit+细胞水平的动态变化，并分选出c-kit+细胞进行细胞培养，免疫荧光染色观察c-kit阳性干细胞。其次，应用ki67、PH3核蛋白，检测骨髓单个核细胞的增殖和分裂情况，印证c-kit+干细胞数量变化与增殖的联系。再次，应用细胞命运决定蛋白Numb和alpha-adaptin的免疫荧光染色来检测AMI后成鼠BM-MNCs中的不对称分裂模式的存在并和乳鼠（出生24小时）进行比较。最后应用免疫荧光染色，选择Numb蛋白检测BM-MNCs细胞亚群c-kit+和c-kit-细胞中对称及不对称分裂现象的存在和比例，并进行统计学的t检验，对比组间差异。研究结果：1.AMI后小鼠骨髓单个核细胞中c-kit+干细胞的观察及其水平变化：（1）PCR结果显示心梗组（术后Day3和Day7）骨髓中c-kit+干细胞的mRNA水平较对照组升高，并且第3天高于第7天；（2）流式细胞术结果提示BM-MNCs中c-kit+干细胞的比例在AMI后有所升高，心梗组第2、3、7天分别为6.98±1.18%、17.13±1.5%、5.95±0.68%，和对照组（4.47±0.88%）相比较具有统计学差异（p <0.05）；AMI后第3天c-kit+干细胞的比例达到高峰值，与相应的第2、7天相比较也具有明显的统计学差异（p <0.05）；（3）磁珠分选术得出和流式细胞术相似的c-kit+干细胞比例变化趋势；（4）免疫荧光染色结果直接观察到了BM-MNCs中c-kit+干细胞的存在。2. AMI后小鼠BM-MNCs和c-kit+干细胞、c-kit-细胞的增殖水平比较：（1）免疫荧光结果确认了AMI后第3和7天BM-MNCs的增殖情况的存在，并利用统计学方法显示心梗组BM-MNCs的ki67和PH3水平均明显高于对照组（p<0.05）；（2）选取心梗后第3天，相应的骨髓细胞亚群c-kit+干细胞组的ki67水平均明显高于c-kit-细胞组（8.34±0.25%vs1.90±0.34%，p <0.05）；（3）两个骨髓单个核细胞亚群的PH3水平也是c-kit+干细胞组高于c-kit-细胞组（5.98±0.34%vs2.26±0.40%，p <0.05）。3. AMI后第3天小鼠和乳鼠的BM-MNCs中不对称分裂的存在及比例的比较：（1）免疫荧光检测显示AMI后小鼠和乳鼠的BM-MNCs均存在Numb的不对称分布于细胞一侧的现象；统计数据显示上述两组细胞的不对称分裂比例分别是11.7±1.25%和9.33±0.94%，两组间的差异无统计学意义，但均高于对照组（p <0.05）；（2）alpha-adaptin的免疫荧光检测结果显示在AMI后小鼠和乳鼠的BM-MNCs也存在命运决定子不对称分布，比例分别是9.41±1.26%和8.33±0.76%，两组间的差异无统计学意义，但两者均高于对照组（p <0.05）；4. AMI后第3天小鼠BM-MNCs细胞亚群中,细胞不对称分裂主要存在于c-kit+干细胞、而不是c-kit-细胞：应用细胞命运决定子Numb蛋白进行免疫荧光检测显示AMI后第3天小鼠c-kit+干细胞和c-kit-细胞组分别可观察到12.57±1.39%和4.17±1.65%的分裂细胞中Numb不对称分布于细胞一侧；两组不对称分裂比例具有统计学差异（p <0.05）。5.冠心病病人的骨髓c-kit+干细胞的存在及其不对称分裂现象观察：磁珠分选术显示冠心病病人的BM-MNCs中约有10%的c-kit+干细胞；c-kit+干细胞和c-kit-细胞Numb的不对称分布比例分别为14.29%和6.06%。研究结论：1.AMI后小鼠BM-MNCs中的c-kit+干细胞亚群对心肌损伤产生反应，受到心肌缺血信号刺激而应激性升高，并相继动员至心脏进行心肌修复；AMI后第3天是应激反应最活跃的时间。2.AMI主要激活骨髓单个核细胞中的c-kit+干细胞进行活跃增殖分裂，发生骨髓动员并发挥心肌损伤的修复作用，而不是c-kit阴性细胞。3. AMI后由于心肌缺血损伤的刺激，小鼠BM-MNCs发生了不对称分裂现象，有一种回到乳鼠的活跃增殖及分裂状态的趋势；4.骨髓中的c-kit+干细胞，而不是c-kit-细胞，对心肌缺血损伤产生明显应激反应，应用不对称分裂模式进行自我更新和分化，保持自身干细胞数量并产生分化细胞发挥心肌修复功能。5.冠心病病人的骨髓在心肌缺血损伤发生后，也会产生c-kit+干细胞的动员，并发生不对称分裂现象，可能与心肌损伤修复具有相关性。