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目的
采用Taqman-MGB探针技术，建立荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)检测DD3mRNA的方法，对前列腺癌患者组织和尿液中DD3mRNA进行定量检测并对其临床应用进行评价。
方法
1．根据Genebank的DD3mRNA序列，在DD3基因的外显子l和3之间设计一对引物和一条Taqman-MGB探针，优化反应体系，建立DD3mRNA的FQ-RT-PCR方法。
2．用pBluescriptIISK载体与普通PCR扩增所得的DD3eDNA片段进行连接，构建重组质粒作为标准品。
3．对本方法进行方法学评价，包括探针稳定性、灵敏度、特异度和精密度等等。
4．收集前列腺癌患者组织和尿液标本，检测DD3mRNA含量并进行临床应用评价。
结果
1．成功建立了荧光定量逆转录聚合酶链反应检测DD3mRNA的方法，本方法检测灵敏度为6拷贝／反应，线性范围为6～6×108拷贝／反应，Ct值与拷贝数之间具有良好的线性关系，相关系数为0．994。批内、批间变异系数分别为1．25～2．06％和2．32-3．59％。扩增产物克隆和测序分析显示本扩增片段为DD3特异性片段。2．27例非前列腺组织中DD3mRNA的含量均小于本方法最低检测限，而21例前列腺癌(PCa)组织、35例良性前列腺增生(BPH)组织和14例正常前列腺组织均可检测到DD3mRNA的表达。PCa较BPH和正常前列腺组织DD3mRNA表达量显著增高，而后两组间则无显著性差异(P>0．05)。经ROC曲线分析，ROC-AUC=0．937(95％Ch0．879～0．995)。前列腺组织DD3mRNA含量以1．4x105拷贝／mg组织为临界值时，灵敏度、特异度、准确度、阳性预测值、阴性预测值、分别为90．5％、94．3％、92．3％、90．5％和94．3％。前列腺组织DD3表达量与临床分期和分化程度之间均无明显相关性。
3．在前列腺穿刺活检前共收集21例PCa和40例BPH患者前列腺按摩后的尿液。由于尿沉渣中不仅含有PCa细胞和非前列腺细胞，还含有尿道上皮细胞，而PSAmRNA在正常前列腺细胞中表达相对恒定，在PCa细胞中的表达有轻度下降(～1．5倍)，所以用PSAmRNA校正尿沉渣中的前列腺细胞(PSAmRNA的检测方法学已建立)。尿液PSAmRNA表达呈阳性的标本才被认为含有足够的前列腺细胞，方可用于DD3mRNA的检测。尿液DD3mRNA含量以DD3mRNA／PSAmRNA的比值表示。PCa组尿液DD3mRNA含量明显高于BPH组，差异具有统计学意义(P<0．05)。尿液DD3mRNA的阳性率与临床分期和病理分级无关。尿液DD3mRNA的ROC曲线分析结果显示，ROC-AUC=0．705f95％Ch0．578～0．832)。尿液DD3mRNA即DD3mRNA／PSAmRNA的比值以0．¨6为临界值时，尿液DD3mRNA诊断PCa的总体灵敏度和特异度为66．7％和80．0％。如果血清PSA以l0ng／ml为临界值，则血清PSA的总体特异度为50．0％(20／40)，尿液DD3mRNA较血清PSA具有更高的特异性。此外血清PSA小于4ng／ml和血清PSA位于4～10ng／ml之间的PCa患者各1例，其尿液DD3mRNA均为阳性，这提示尿液DD3mRNA检测可能有助于检出低血清PSA的PCa患者。
结论
1．成功建立了荧光实时定量逆转录聚合酶链反应检测DD3mRNA的方法，本方法具有敏感、特异、准确、高效、重复性好、结果数据化等特点。
2．PCa组织中DD3mRNA特异性高表达，为DD3mRNA成为PCa诊断和监测指标提供了理论依据。
3．尿液DD3mRNA用于PCa诊断较血清PSA有更高的特异性，且可能有助于检出低血清PSA的PCa患者，在PCa的早期诊断中也有潜在的应用价值。