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初生和断奶仔猪大肠杆菌性腹泻病的主要病原是肠毒素性大肠杆菌(ETEC)。ETEC的致病性与其具有黏附性的菌毛和产肠毒素的能力密切相关，二者缺一不可。但由于菌毛的血清型多而复杂，肠毒素只有热敏肠毒素(LT)和耐热肠毒素(STⅠ、STⅡ)两种，因此成为研究的对象。用三对扩增产物分别为110bp、237bp、368bp的引物建立了检测LT和STⅠ、STⅡ毒素基因的多重PCR方法。扩增产物分别用Hind Ⅲ、HincⅡ、Sau3AⅠ限制性内切酶酶切，均得到与预期一致的2个片段。对各个参考株的检测结果为100％符合。结果表明该多重PCR方法具有很好的特异性和敏感性。该方法可用于肠毒素性大肠杆菌腹泻病的辅助诊断以及大肠杆菌的分类检测。 利用PCR和点突变PCR技术，参考国内外已有文献，自行设计引物分别扩增了猪源大肠杆菌热敏肠毒素(LT)、B亚基(LTB)和突变体LTK63、LTR72的基因片段，将扩增片段克隆于pMD18-T载体，经酶切鉴定、PCR鉴定及DNA序列测定，表明扩增的基因为目的片段，并且突变体在相应的位置进行了突变。所扩增的LT与Genbank中报道的猪源(LTp)、人源(LTh)禽源(LTc)LT序列具有极高的同源性，同源性在98％～99.6％之间；氨基酸分析表明同源性也很高，分别为：与LTp同源性96.6％；与LTh同源性94.5％；与LTc同源性94.5％。LT基因二级结构预测及LT分子抗原性分析表明LT有高度的保守性。由于LT、突变体LTK63、LTR72均带有自己的启动子，故pMD18-LT、pMD18-LTK63、pMD18-LTR72即为重组表达质粒，其表达蛋白的黏膜免疫佐剂活性有待于进一步研究。 应用DNA重组技术，将LTB基因克隆到原核表达质粒载体pBV220中，并转化大肠杆菌DH5α中，通过温度诱导表达，在大肠杆菌中表达了重组的LT。SDS-PAGE电泳显示，其分子量为11.5KD左右，42℃，4～5h表达产物最多，约占总菌体蛋白的20％左右。超声波裂解初步分离后，表达产物主要以包涵体形式存在，但在细胞的上清中也有相当的含量。B亚基是LT的免疫原性中心，重组LTB(rLTB)除可以用于亚单位疫苗的研 摘 要制，还可作为佐剂研究的后选株。虽然 rLTB的免疫佐剂活性不如 LT强，但一旦产生了高的抗体滴度，仍然具有很强佐剂活性。