树突状细胞(Dendritic cells,DCs)被认为是体内提呈抗原能力最强的专职抗原提呈细胞,是连接固有免疫和适应性免疫的中心环节。成熟活化的DCs不仅能将抗原传递提呈给初始的淋巴细胞,还可通过分泌的细胞因子调节适应性免疫应答的类型。模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)是一类由胚系基因编码的主要表达于固有免疫细胞表面的一类受体。PRRs可识别病原微生物表面的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),实现对外来病原体的早期识别。抗原提呈细胞,特别是树突状细胞和巨噬细胞,其表达的PRRs活化后可增强其抗原提呈能力,同时启动和调节适应性免疫反应,因而PRRs也是连接适应性免疫和固有免疫的桥梁。目前,Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)和 NOD 样受体(NOD-like receptors,NLRs)是研究得较为深入的受体。树突状细胞表达几乎所有的PRRs,研究表明,细菌的某些成分,包括合成的激动剂,通过DCs的PRRs,可刺激DCs的活化成熟,增强其抗原提呈能力,并调节和介导适应性免疫反应。因而本实验将筛选出具有协同刺激DCs成熟并可调节Th2型免疫反应的TLR和NLR配体,并对相关的机制进行初步研究。本次试验将通过以下3部分进行:实验一:TLR与NLR配体对DCs成熟的影响实验将研究TLRs与NLRs对DCs成熟活化的影响,并检测TLRs与NLRs对DCs的成熟是否具有协同效应。DC2.4细胞经TLR4配体LPS,TLR2配体Pam,NOD1配体DAP,NOD2配体MDP,NLRP3配体Chitosan(CS)的分别刺激及TLR和NLR配体的联合刺激24h后,通过流式细胞术检测细胞表面标志CD40,CD80,CD83,CD86,MHC-Ⅱ分子的表达,结果显示刺激后的细胞与空白对照组相比,DCs的表面标记分子表达均高于空白对照组,且联合刺激组的表达高于单刺激组,显示出联合刺激的协同效应。表明TLRs与NLRs可协同促进DCs的成熟活化。实验二:TLR与NLR配体对DCs分泌细胞因子及介导Th免疫反应的影响试验将筛选可协同调节Th2型免疫反应的TLR和NLR配体。DC2.4细胞经TLR4 配体 LPS,TLR2 配体 Pam,NOD1 配体 DAP,NOD2 配体 MDP,NLRP3 配体CS的分别刺激及TLR和NLR配体的联合刺激8小时及24小时,RT-PCR检测细胞经8小时刺激后IL-4,IL-6,IL-10,IL-12p35,IL-12p40等细胞因子的mRNA水平以及ELISA检测刺激24小时后细胞上清中IL-4,IL-6,IL-10,IL-12的分泌水平。结果显示LPS和CS可以协同刺激IL-4的分泌增加而IL-12的分泌降低,协同调节Th2型免疫反应。实验三LPS和Chitosan协同促进Th2型免疫反应的机制研究基于以上两个试验的结果本实验将初步探索在LPS+CS的联合刺激下,DCs调节Th2型免疫反应涉及的机制。本实验将对MAPKs和NF-κB信号通路进行研究,在细胞受到刺激0,15,30,60,90 mins后检测MAPKs信号通路中ERK,JNK,p38的磷酸化及非磷酸化的变化以及NF-κB信号通路中I-κB和NF-κB的改变。结果表明,在LPS+CS的刺激下,ERK的活性增加而JNK和p38的活性抑制,NF-κB活性增强。初步证明ERK与NF-κB是介导DCs分泌Th2型细胞因子的重要信号分子。