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目的: 硒对神经退行性疾病的氧化还原调控具有重要作用。幼鼠脑发育中,缺硒与脑源性神经营养因子的基因表达的降低有关。硒能通过抗氧化、调节信号通路来减少β淀粉样蛋白(Aβ )产生、降低Aβ 细胞毒性,抑制神经纤维缠结(neuro fibrillary tangle,NFT)的形成,改善认知缺陷,从而阻止阿尔茨海默综合征(Alzheimer’s disease,AD)的发生发展。人体内的铁随着年龄的增长而增加,增加的铁离子产生过量的一系列活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)引起细胞信号紊乱,使微管相关蛋白(tau蛋白)过度磷酸化,异常过度磷酸化的tau蛋白易在退变神经元的胞体聚集成双螺旋丝(paired helical filamend,PHF)结构,导致NFT的形成而失去了其生物学功能,tau蛋白的异常过度磷酸化被广泛认为是AD致病过程中的早期关键事件。硒酵母可以显著性提高AD小鼠的记忆能力,降低脑内淀粉样蛋白前提蛋白(Amiloid precursor protein, APP)、aβ 及tau蛋白水平,提高硒含量及硒酶活性,并加强脑内抗氧化能力。体内体外实验都证明,硒代蛋氨酸或硒酵母一方面可以通过抑制APP,从而减少Aβ 的生成;另一方面通过调节自噬信号通路,调控自噬水平,并促进自噬体向自噬溶酶体的转化,加强对Aβ 、Tau蛋白等病理蛋白的清除。 本研究主要探讨硒酸钠对过量铁诱导的tau蛋白过度磷酸化的影响及其机制,分析硒化合物通过调节信号通路抗氧化的效果,从而解析硒化合物在治疗和预防AD病的可能机制。 方法: 将人神经瘤细胞母细胞SH-SY5Y细胞用0.1μM硒酸钠预处理后加入50μM硫酸亚铁,活性氧试剂盒检测细胞氧化应激水平,免疫印迹法检测tau蛋白在Thr231、Ser396和Ser404等位点的磷酸化水平,用ELISA检测蛋白磷酸酶2A (protein phosphatase 2A,PP2A)、磷酸化PP2A(p-PP2A)、糖原合成酶激酶3β(glycogen synthesis kinanse-3β,Gsk3β)和p-Gsk3β的活性。CCK-8试剂盒检测细胞增殖和细胞活力。 结果: 1.确定了硒酸钠和硫酸亚铁最适处理浓度:为了避免药物处理引起细胞死亡对实验的影响,后续实验中使用CCK-8法确定硒酸钠和铁的最佳实验浓度为50μ M的硫酸亚铁和0.1μM的硒酸钠。 2.硒酸钠抑制过量铁引起的 tau 蛋白的过度磷酸化:相对于硫酸亚铁处理组,硒酸钠预处理显著降低了tau蛋白在Thr231,Ser396和Ser404等位点的过度磷酸化,分别降低了51.08 ± 13.37%(p<0.05),42.59 ± 13.65%(p<0.05), 38.42 ± 13.80% (p< 0.05)。 3.硒酸钠降低过量铁引起的ROS:与对照组相比,硫酸亚铁处理的细胞中ROS水平显着增加至155.4±3.79%(p<0.01)。然而,与硫酸亚铁处理组相比,用硒酸钠预处理的细胞ROS的产生减少了38.70±4.52%(p<0.01)。与空白对照组相比,用硒酸钠处理的细胞的ROS水平没有显著性差异。 4.硒酸钠调节过量亚铁离子引起的 PP2A 和 Gsk3β 活性的改变:Western blot结果显示硒酸钠和硫酸亚铁处理没有改变细胞中的PP2A表达水平。然而,与对照组相比,硫酸亚铁处理的细胞中p-PP2A/PP2A的比例显着增加至186.1± 20.57%(p<0.05)。硒预处理组能够显著降低硫酸亚铁引起的p-PP2A/PP2A的变化,与硫酸亚铁处理组相比降低了42.89±12.05%(p<0.05);此外,与对照组相比,硫酸亚铁处理组细胞中 p-GSK3β /GSK3β 显著降低了 62.05±3.985%(p<0.05)。而硒酸钠预处理组的细胞中p-GSK3β /GSK3β 水平增加了23.73± 9.478%(p<0.05)。总GSK3β 的蛋白质水平在所有组中保持不变。 结论: 铁是人体内含量最丰富的过渡金属元素,广泛存在于脑内各个部位,起着重要的生理作用。在高度磷酸化状态下,过量铁会提高细胞内的氧化应激水平,通过调节PP2A和Gsk3β 的活性引起tau蛋白的过度磷酸化。而经过硒酸钠预处理的细胞在一定程度上抑制过量铁带来的细胞氧化应激水平以及PP2A和Gsk3β 活性的变化,从而减少过量铁引起的tau蛋白过度磷酸化。本研究为进一步研究硒酸钠预防AD的机制提供了新的途径。