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非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是全球第一大非感染性肝病,它是胰岛素抵抗(IR)和遗传易感性相关的代谢应激性肝脏损害,其主要疾病谱表现为单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、NASH相关肝硬化(NASH-LC)及肝癌。虽然“二次打击”学说已成为解释NAFLD的经典理论,但可能发病机制尚未阐明。内质网(ER)是真核细胞中一种重要的细胞器,它主要参与蛋白质的合成、组装、折叠、运输、细胞内钙的储存,以及脂质代谢与类固醇激素的合成。在缺氧、氧化应激、异常糖基化反应以及Ca2+稳态失衡等情况下,未折叠蛋白增多,超出内质网的处理能力时,可导致内质网应激(ERS)。ERS分为三种类型：(1)细胞核因子κ(NF-κB)引发的内质网超负荷反应(EOR)；(2)固醇调节级联反应；(3)未折叠蛋白反应(UPR)。在肝细胞脂肪变性过程中,ERS的调控十分重要,且内质网应激(ERS)与NAFLD的发生发展密切相关,ERS中的未折叠蛋白反应(UPR)在NASH、糖尿病等代谢疾病引起的肝损害进展中起着关键作用。然而NAFLD如何启动,内质网脂质负荷的增多如何引起内质网内未正确折叠蛋白的增多,肝细胞内脂质负荷过载与ERS的发生之间更直接的联系是什么,这些问题并未得到明确回答。Sec61蛋白是内质网上重要的通道蛋白,也是未折叠蛋白转运及后续的未折叠蛋白降解途径(ERAD)的核心结构,对ERS的平衡,维持ER复杂功能起着重要作用。它包括α、β、γ亚基,其主要功能是形成疏水通道,使核糖体合成的新生多肽通过并穿过内质网的内腔,完成正确折叠。作为一种通道蛋白,Sec61是否在肝细胞脂肪变性模型中发生了变化,是否参与肝细胞脂肪变性的过程,目前尚未见报道。因此,本研究建立软脂酸与油酸混合物体外诱导肝细胞脂肪变性模型,检测Sec61a与内质网Ca2+密切相关的葡萄糖调节蛋白94(GRP94)、Bcl-2,以及ERS标志蛋白葡萄糖调节蛋白78(GRP78)的表达,探讨Sec61a在肝细胞脂肪变性中的可能作用机制。方法：1.应用软脂酸与油酸混合物;PA:OA=1:2)诱导L02肝细胞发生肝细胞脂肪变性,建立非酒精性脂肪性肝病肝细胞脂肪变体外模型,分为正常对照组与脂肪变性组,分别于0h、2h、4h、8h及16h收获细胞。2.采用油红O染色显示肝细胞胞质内脂滴情况,利用相差倒置显微镜观察其脂肪变化程度；每组肝细胞随机选取5个视野进行采图,并应用Image J软件进行图像分析,以平均脂变面积评价肝细胞脂变程度。3.根据L02细胞脂肪变性过程中,是否加入Sec61抑制剂Eeyarestatin I,将细胞分为正常对照组、脂肪变性组、Sec61抑制剂组及DMSO组。4.利用qRT-PCR及Western blot检测各时相点Sec61α、GRP78、GRP94及Bcl-2的表达变化。5.采用SPSS19.0软件进行统计学分析。结果：1.油红O染色评价软脂酸与油酸混合物诱导L02肝细胞脂肪变情况油红O染色后显微镜下观察,脂滴为红色,而随着造模时间延长,细胞质内脂滴明显增多,逐渐融合成点片状,并呈现逐渐增加趋势。2h的脂变面积为3.36+0.32,4h为22.53±2.16,8h为85.27±13.82,12h253.94±21.68,16h为427.56±29.73,均较0h显著升高(P<0.01)。2.qRT-PCR检测L02肝细胞脂肪变性过程中,Sec61a与GRP78的mRNA动态变化水平在1mRNA水平,以0h的表达为1,Sec61αmRNA相对表达量在细胞脂肪变模型早期(2h、4h)出现下降(P>0.05),而在后期增加(8h、12h、16h,P<0.05)；GRP78的表达也呈逐渐上升态势,8h明显上升(P<0.05),在12h、24h较0h显著升高(P<0.01)。3. Western blot检测L02肝细胞脂肪变性过程中,Sec61α与GRP78蛋白的动态变化水平在蛋白水平上,Sec61α在肝细胞脂肪变性早期下降(2h,4h,P>0.05),晚期升高(8h,12h,P<0.05)的变化规律；GRP78蛋白表达呈逐渐上升的变化规律(P<0.05)4.油红O染色评价应用Sec61抑制剂Eeyarestatin I处理后,肝细胞脂肪变性程度油红O染色后显微镜下观察,DMSO组与脂肪变性组的脂变面积差异不明显,无统计学意义(P>0.05),而抑制剂组与脂肪变性组的脂变面积差异明显(P<0.01)。5.Western blot检测应用Sec61抑制剂后各组蛋白表达变化在蛋白水平,脂肪变性组与DMSO组比较,无统计学差异(P>0.05),而抑制剂组中Sec61α与GRP78蛋白水平与脂肪变性组相比,明显降低(P<0.01)；GRP94与Bcl-2则明显升高(P<0.01)。结论：1.应用软脂酸与油酸混合物可成功建立肝细胞脂肪变性体外模型,且随时间延长,肝细胞胞质中脂滴面积也不断增加。2.内质网应激贯穿于肝细胞脂肪变的整个过程,随时间延长,ERS逐渐加重。3.内质网孔道蛋白Sec61在肝细胞脂肪变性过程中的早期(2h,4h)先下降,此时ERS虽有发生,但程度较轻,Sec61的变化可能是一种适应性变化。在肝细胞脂肪变后期(8h,12h,16h),Sec61随ERS进一步加重,表达逐渐升高。在加入Sec61抑制剂后,ERS明显减轻,肝细胞脂肪变性程度同步减轻,提示在肝细胞脂肪变性过程中,Sec61α可能通过调节内质网GRP78蛋白介导ERS系列反应,参与肝细胞脂肪变的发生发展。4.GRP94与Bcl-2应用Sec61抑制剂后,在抑制剂组表达较脂肪变性组明显升高,提示在肝细胞脂肪变性过程中,其可能通过调节肝细胞内Ca2+浓度变化,参与ERS,从而影响肝细胞脂肪变的进展。