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目的:构建含特异性针对Livin siRNA的重组腺病毒,抑制Livin基因的表达,观察重组腺病毒对K562细胞的增殖、凋亡及耐药的影响,为进一步探索白血病的基因治疗提供实验依据。方法:1.构建含特异性Livin siRNA的重组腺病毒。酶切穿梭质粒pSES-HUS,用DNA连接试剂盒将载体和目的siRNA定向克隆连接,筛选和鉴定重组质粒pSES-HUS-Livin siRNA。基因测序,把正确的重组质粒导入腺病毒同源骨架质粒BJ-Adeasy中,产生腺病毒质粒Adeasy-Livin siRNA,酶切鉴定。同源重组成功的质粒,用脂质体介导的方法转染腺病毒包装细胞,乒乓感染收获高滴度的Ad5-Livin siRNA。2.检测转染Ad5-Livin siRNA对K562细胞Livin表达的影响。实验分为四组:未转染组,转染重组腺病毒空载体组,转染Ad5-Livin siRNA-1组和Ad5-Livin siRNA-2组。应用流式细胞术,Real-time PCR和Western Blot方法检测Livin基因的干扰效果。3.检测Ad5-Lvin siRNA对K562细胞增殖及凋亡的影响。采用MTT和AnnexinV-FITC/PI方法检测转染病毒后细胞增殖和凋亡的变化。4.检测转染Ad5-Lvin siRNA对K562细胞耐药性的影响。选用不同浓度的阿霉素、依托泊苷、长春新碱和顺铂,通过MTT法抗癌药物敏感试验检测干扰Livin基因后细胞耐药性的变化。结果:1.成功构建重组腺病毒质粒Adeasy-Livin siRNA,并转染包装细胞,得到高滴度的重组腺病毒,病毒滴度达到1.1×1011pfu/ml。2.K562细胞转染重组腺病毒后,MOI=100时,转染率及存活率均较好,转染率为15.91%。3.K562细胞中Livin mRNA和蛋白高表达,转染siRNA组的Livin表达下调,而转染空载体组无明显变化(p<0.01)。4.重组腺病毒沉默Livin基因后,与对照组相比,明显抑制K562细胞的增殖,诱导其自发凋亡,结果有统计学意义(p<0.05)。5.转染Ad5-Livin siRNA增加K562细胞对化疗药物的敏感性(如ADM、VP16、VCR),各药的IC50均明显下降,与未转染组及转染空载体组相比,结果有统计学意义(p<0.01)。但重组腺病毒对DDP没有影响(p>0.05)。结论:1.应用分子生物学方法构建并收获高滴度的含靶向Livin siRNA的重组腺病毒。2.通过腺病毒载体可将Livin siRNA成功转染K562细胞,可下调Livin mRNA和蛋白表达。3.RNA干扰Livin基因可抑制K562细胞的增殖,促进凋亡。4.RNA干扰Livin基因可增加K562细胞对阿霉素、依托泊苷和长春新碱的敏感性。