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背景:皮肤黑色素瘤是一种罕见的皮肤癌,以毫米为单位的肿瘤就具有致死性,与其他类型皮肤癌相比,皮肤黑色素瘤具有恶性程度高,易发生远处转移,临床预后差的特点,为患者带来了无尽的痛苦和经济负担。目前常用的治疗手段主要以手术切除治疗为主,晚期患者常采用放、化学疗法,但患者生存率较低。因此迫切需要寻找更多元的作用靶点。溴结构域和超末端结构域(bromodomain and extra-terminal,BET)家族的抑制剂(BET inhibitors,BETi)被认为是有前景的黑色素瘤疗法之一。JQ1能靶向溴结构域蛋白4(bromodomain protein 4,BRD4),通过模仿乙酰基,与BRD4蛋白特有的乙酰化赖氨酸口袋结合,阻止BRD4下游基因转录。JQ1对黑色素瘤的影响的研究大都集中在调节细胞凋亡、细胞周期等过程,但上述机制并不能完全阐明BETi在皮肤黑素瘤中的治疗作用。线粒体作为能量调节的中心调控肿瘤细胞的命运,而黑色素瘤细胞对糖酵解的变化更加敏感,说明黑色素瘤细胞的线粒体变化在疾病发生中可能起重要作用。线粒体动力学作为维持线粒体功能和形态的关键因素,是线粒体功能的主要调节者,其融合和分裂平衡的破坏会损害线粒体。因此,本研究将对BRD4能否通过调节线粒体动力学在黑色素瘤中发挥作用进行重点研究。目的:本研究使用BRD4抑制剂JQ1作用于黑色素瘤B16细胞,观察JQ1对黑色素瘤细胞生长、凋亡、线粒体功能、线粒体动力学和能量代谢的影响,探讨BRD4在黑色素瘤中的作用机制。方法:1.通过数据库分析BRD4在黑色素瘤中的表达情况2.使用MTT、细胞生长计数、平板克隆实验研究BRD4抑制剂JQ1对B16细胞活力和增殖的影响,细胞划痕和western blot实验检测JQ1对B16细胞迁移的影响。3.流式细胞术、Hoechst染色以及western blot实验检测JQ1对B16细胞凋亡、细胞周期、线粒体膜电位、ROS含量的影响,JC-1和ROS免疫荧光进一步证实线粒体膜电位和ROS的变化。4.提取线粒体蛋白和mt DNA,利用western blot和q PCR技术分析线粒体功能和线粒体质量改变。5.通过生化试剂盒检测细胞葡萄糖含量、乳酸生成量、脂质合成情况反映JQ1对B16细胞能量的调节。6.通过mito-tracker green线粒体染色、透射电镜技术、western blot和q PCR技术证实JQ1对B16细胞的调节与线粒体动力学有关。结果:1.数据库分析显示BRD4在黑色素瘤中高表达,抑制BRD4能抑制黑色素瘤B16细胞增殖和迁移。2.抑制BRD4可以通过线粒体途径促进B16细胞凋亡,诱导细胞G1期阻滞。在JQ1处理黑色素瘤细胞后,线粒体细胞色素C释放到胞质中增加,线粒体凋亡相关蛋白cleaved-caspase 9表达增加,线粒体膜电位(ΨΔm)以剂量依赖性方式降低。3.抑制BRD4可以通过降低线粒体电子转运链的活性,下调呼吸链复合物重要亚基NDUFV1、CYC1、COX7C和ATP5F1蛋白表达,最终导致线粒体功能发生障碍,这可能与mt DNA拷贝数降低有关。4.BRD4的抑制能降低黑色素瘤葡萄糖摄取和脂肪酸合成。用不同浓度的JQ1(125n M或250n M)处理后,改变了黑色素瘤细胞的能量代谢,导致葡萄糖摄取,乳酸生成,脂肪生成均减少。5.BRD4的抑制通过改变线粒体动力学调节黑色素瘤的凋亡和代谢。JQ1处理后B16细胞线粒体动力相关蛋白1(Drp1)表达增加,线粒体融合蛋白(Mfn1和Mfn2)和视神经萎缩蛋白1(OPA1)表达下降。透射电镜显示JQ1处理的细胞线粒体分裂增多。进一步验证其机制发现,在JQ1处理黑色素瘤B16细胞前1h加入线粒体分裂抑制剂Mdivi-1(2μM),观察到细胞凋亡明显减少,ROS生成减少,线粒体膜电位有所回升,B16细胞糖脂代谢下调有所恢复。结论:1.抑制BRD4能抑制黑色素瘤B16细胞增殖和迁移,这可能与抑制c-myc蛋白有关。2.抑制BRD4能导致线粒体功能障碍,影响糖脂代谢并通过线粒体途径介导B16细胞凋亡。3.抑制BRD4能改变B16细胞线粒体动力学,使线粒体分裂增加,这可能与线粒体途径凋亡增加有关。