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为了探索气体信号分子一氧化碳(CO)和硫化氢(H2S)对次生代谢物三萜积累的影响及其作用机制,本文以桑黄(Phellinus)菌丝体和白桦悬浮细胞为材料,将不同浓度的CO和H2S供体氯高铁血红素和硫氢化钠分别添加到培养8d的白桦悬浮细胞培养体系或桑黄菌丝液体培养体系中,筛选促进三萜积累的最适浓度和时间。在此基础上,通过药理学实验,即添加CO清除剂血红蛋白(Hb)和H2S清除剂亚牛磺酸(HT),分析CO和H2S信号分子之间的互作对话以及两信号分子对碳代谢及硫代谢的影响。上述研究将为阐明CO和H2S的信号对话模式及其在有用次生代谢物合成中的调控功能提供一定的理论支撑,同时也丰富了调控次生代谢物合成的理论内涵。主要研究结果如下：1、CO处理对三萜积累的影响将不同浓度的CO供体氯高铁血红素分别添加到培养8d的白桦悬浮细胞和桑黄菌丝培养体系中处理6h～8d后,发现CO处理均可促进两种培养物中三萜的合成。其中,30μmol/L CO处理白桦悬浮细胞1d时,三萜积累量达到最大值,比对照组提高了31.1%。同时,白桦悬浮细胞中三萜合成关键酶基因表达水平上调。20μmol/L和10μmol/L CO分别处理桑黄菌丝1d和4d时白桦脂醇和三萜积累量达最大值,分别比同期对照组提高了31%和29.6%。2.、H2S处理对三萜积累的影响将不同浓度的H2S供体硫氢化钠添加到培养8d的桑黄菌丝培养体系中处理6h～4d后,发现H2S处理可以不同程度的提高三萜和白桦脂醇的积累。其中,2mmol/L H2S处理1d时三萜和白桦脂醇积累均达到最大值,分别比同期对照组提高了40%和17.1%。3、CO和H2S处理促进三萜积累的信号对话研究为了明确CO和H2S处理促进三萜积累中内源CO和H2S及其信号对话与三萜积累的关系。将CO和H2S清除剂HT、H2S和CO清除剂Hb分别添加到桑黄菌丝培养体系中,研究发现CO处理增加了桑黄菌丝中H2S含量、H2S合成关键酶半胱氨酸脱巯基酶的活性、三萜和白桦脂醇积累量,而上述指标在CO和H2S清除剂HT共同处理后受到抑制,但其受抑制后的值仍高于对照；H2S处理增加了桑黄菌丝中CO含量、CO合成关键酶血红素加氧酶的活性、三萜和白桦脂醇积累量,而上述指标在H2S和CO清除剂Hb共同处理后受到抑制,但其受抑制后的值仍高于对照。由上述结果可以推断内源CO和H2S及其信号对话参与了三萜积累的调控。4、CO和H2S处理促进三萜积累中碳代谢的变化研究CO、H2S分别处理后增加了桑黄菌丝中蔗糖含量、果糖含量和蔗糖磷酸合成酶活性,而对葡萄糖含量的影响不显著维持在对照水平。CO促进了蔗糖合成酶活性,而H2S表现出抑制作用。进一步将不同浓度的蔗糖、果糖和葡萄糖分别添加到CO、H2S处理的桑黄培养体系中,发现CO和蔗糖、果糖及葡萄糖分别互作处理后,三萜积累量高于CO单独处理,而H2S与蔗糖、果糖及葡萄糖分别互作处理后三萜含量却比H2S单独处理降低了。由上述结果可以推断碳代谢参与了CO处理促进三萜的积累。5、CO和H2S处理促进三萜积累中硫代谢的变化研究CO、H2S分别处理后增加了桑黄菌丝中总硫含量、S-亚硝基硫醇含量、谷胱甘肽含量及其谷胱甘肽还原酶基因表达量。而对于丙酮酸含量的影响,CO处理呈增加趋势而H2S处理呈降低趋势。进一步采用药理学试验分析发现,CO和H2S清除剂HT、H2S和CO清除剂Hb处理后S-亚硝基硫醇、总硫和谷胱甘肽含量比单独CO和H2S处理后呈下降趋势,但仍高于对照值。由上述结果可知,CO和H2S处理后改变了桑黄菌丝中的硫代谢,而硫代谢与三萜积累的关系是本课题组下一步开展的工作。