研究背景:银屑病是常见的慢性炎症性皮肤病,其发病机制十分复杂,由遗传、环境和免疫等共同介导,微生物感染被认为是银屑病发病的既定危险因素和重要诱因,但关于微生物是如何参与银屑病的发病过程仍不完全清楚。目前的研究大多集中在银屑病皮损与健康皮肤表面的微生物丰度的变化,关于皮肤表面菌群及代谢与宿主之间的互作仍有较多未知,研究其功能和机制有助于更好地了解银屑病。色氨酸（Trp）是微生物代谢的重要能量来源,Trp代谢途径在多种生理过程中发挥关键作用,包括生长调节、新陈代谢、情绪和免疫反应。近年来,微生物Trp代谢及产物在免疫调节,尤其是免疫抑制中受到广泛关注。研究发现,它们在调节炎症性疾病及免疫组织成熟中发挥关键作用,例如炎症性肠病、类风湿性关节炎和特应性皮炎等,但关于银屑病与菌群Trp代谢之间的关系尚未有研究。微生物的Trp代谢可产生多种具有芳香烃受体（Ah R）结合能力的代谢产物如Kyn、IAId、QA等,参与调节宿主免疫反应的各个方面。皮肤作为人体最大的器官,表面栖息的多种多样的微生物,密切参与皮肤生理过程,但关于皮肤菌群Trp代谢的研究仍然有限。作为Trp代谢的主要末端产物,皮肤表面微生物菌群产生的QA是否参与银屑病的发生发展需要进一步研究。基于此,本课题围绕QA对银屑病的作用展开研究。研究目的:1.明确银屑病患者皮肤表面菌群Trp代谢产物的表达水平及疾病相关性。2.探讨QA在体内外炎症环境中对角质形成细胞增殖及炎症的影响,以及在银屑病发病中的作用。3.明确QA参与银屑病炎症过程的下游通路及靶分子。4.揭示QA在银屑病发生发展中的作用及其具体机制。研究方法:1.利用凝胶法收集健康对照、寻常型银屑病患者手臂皮损处及非皮损处的微生物菌群样本,采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的方法检测Trp三条代谢途径中的一些主要产物,包括Kyn,tryptophol,5-HTP,IAId,QA等。2.将小鼠随机分为WT组、Ctr组、IMQ组和IMQ联合QA处理组。采用小鼠耳朵连续涂抹IMQ 7天的方式构建银屑病样小鼠皮炎模型,记录小鼠耳部厚度的每日变化情况,观察各组小鼠银屑病样皮炎表型,收集小鼠皮损样本进行苏木精伊红（HE）染色以观察组织病理学改变,包括表皮增殖及炎症细胞浸润情况等。接着,收集各组小鼠的耳部组织制备单细胞悬液,利用流式细胞术检测各组小鼠耳朵CD4+T、CD8+T和Ly6G中性粒细胞的比例变化。3.体外培养Ha Ca T角质形成细胞系,加入混合细胞因子Mix刺激24 h,通过RT-PCR检测并分析银屑病病理过程中相关的细胞因子及趋化因子等变化,并对细胞上清进行ELISA检测,关注炎症因子及炎症小体相关分子的分泌。利用健康人包皮组织提取人原代角质形成细胞,体外培养后加入混合细胞因子Mix刺激48 h,Western Blotting检测QA作用角质形成细胞炎症小体的主要类型,并检测IL-1β、CASP-1（Caspase-1）、IL-18的前体和成熟体水平,利用IMQ涂抹7天的银屑病样皮炎模型中验证上述体外结果。4.在混合细胞因子Mix刺激Ha Ca T细胞的银屑病细胞模型基础上,利用Western Blotting及免疫荧光检测QA刺激后细胞浆和细胞核中Ah R的变化及定位。使用Ah R si RNA干涉片段转染Ha Ca T细胞,Western Blotting检测Ah R干涉后QA对Mix刺激的银屑病细胞模型中NLRP3炎症小体、（IL-1β、CASP-1、IL-18）的前体和成熟体表达水平变化,以及p65磷酸化的检测。5.将C57小鼠随机分组,每组3只,分别为DMSO涂抹的对照组、IMQ组、IMQ+QA联合处理组、Ah R si RNA+IMQ+QA联合处理组,7天造模结束后,观察各组小鼠耳部炎症程度及厚度变化,HE染色观察各组小鼠皮损组织病理学特征。提取小鼠耳朵组织蛋白,Western Blotting和RT-PCR检测各组小鼠耳部表皮NLRP3炎症小体、CASP-1和IL-18的前体、成熟体水平及相关分子的表达。免疫荧光进一步验证各组小鼠皮肤表达的NLRP3、ASC、CASP-1等分子的表达。研究结果:1.LC-MS/MS检测分析发现,QA在银屑病患者皮损中的表达水平显著低于非皮损及健康对照,QA表达水平与银屑病患者严重程度指数（PASI）之间存在显著负相关。一些其他Trp代谢产物（包括5-HTP,IAId,tryptophol）的表达水平在银屑病患者和健康对照受试者之间没有显著差异。2.在IMQ诱导银屑病样小鼠模型基础上,发现QA处理可以显著减轻IMQ诱导的小鼠银屑病样皮炎表型,小鼠皮肤的鳞屑和红肿程度明显减少,用IMQ+QA处理的小鼠的耳朵厚度在多个时间点（5d、7d）均显著低于单独使用IMQ处理的小鼠。HE染色显示,IMQ+QA处理的小鼠耳部表皮厚度和炎症细胞浸润均显著减少。背部表皮中包括Ki67、角蛋白（K）6、K16和K17的m RNA和蛋白水平均显著降低,QA处理后小鼠表皮增殖水平得到了缓解。流式细胞术检测结果显示,IMQ+QA组小鼠皮损处CD4+T细胞和Ly6G+中性粒细胞明显少于IMQ组,而CD8+T细胞比例无显著差异。与IMQ组相比,IMQ+QA组小鼠的IL-1β、IL-6、IL-18、S100A8和CXCL1显著降低。3.体外培养了角质形成细胞Ha Ca T细胞系,混合细胞因子Mix加QA处理细胞24 h后,IL-1β、IL-6、IL-18、IL-23、S100A8、S100A9和CXCL1的m RNA表达水平均显著下降。ELISA进一步验证了这一结果,发现QA处理后的细胞上清中IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α和CASP-1的分泌显著减少,与m RNA结果一致。Western Blotting结果显示,在用混合细胞因子Mix+QA刺激后,角质形成细胞NLRP3的表达显著下降,而NLRC4和AIM2类型炎症小体的表达无显著变化。在IMQ诱导的银屑病小鼠模型中发现,QA同样抑制了银屑病小鼠表皮中NLRP3的表达水平。4.体外培养Ha Ca T细胞,发现QA处理的细胞CYP1A1的m RNA和蛋白质水平均显著增加。使用si RNA干涉角质形成细胞中的Ah R表达,发现加入QA可显著抑制NLRP3炎症小体及其相关分子的表达,在干涉Ah R表达后,QA对NLRP3炎症小体以及IL1-β、IL-18和CASP-1分泌的抑制作用均不同程度地得到恢复。5.将Ah R特异性si RNA局部应用于小鼠耳部,发现干涉Ah R的表达后再给与小鼠耳部IMQ涂抹可加剧银屑病样表型,包括耳部厚度的增加和红斑加重,HE结果也显示出明显升高的增殖水平。Western Blotting、RT-PCR和免疫荧光结果均显示,在QA+IMQ处理的银屑病小鼠模型中,干涉Ah R可回复NLRP3、ASC、mature-CASP-1和IL-1β在m RNA和蛋白水平的表达。结论:本研究首次发现银屑病患者皮肤表面存在微生物菌群的Trp代谢异常,其终末端产物QA异常低表达,且与PASI评分呈显著负相关。QA一方面可以通过抑制角质形成细胞增殖参与抑制银屑病,另一方面可以通过激活Ah R负向调节角质形成细胞NF-κB/NLRP3炎症小体的激活,以及IL-1β、IL-18的分泌等参与抑制银屑病的发生发展。本课题首次证实了银屑病患者皮肤表面菌群Trp代谢的存在,阐明了其终末端代谢产物QA在抑制银屑病中的作用和机制,为银屑病发病机制中微生物菌群代谢与皮肤宿主之间的相关性提供了新的数据和理论基础,提示QA可成为潜在的银屑病干预和治疗靶点,值得在未来研发工作中予以关注和转化。