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目的:骨肉瘤(osteosarcoma, OS)是常见的骨骼原发性恶性肿瘤,其好发于青少年,且易早期发生肺转移、骨转移,5年生存率低,是严重影响青少年身心健康的恶性疾病。尽管在早期手术及辅助化疗可以明显改善患者的预后,但仍为目前死亡率和致残率较高的恶性疾病。而对于远处转移的患者化疗为唯一有效的方法。目前可供临床选用化疗药物有限,也普遍存在耐药的问题,因此,研制、筛选毒副作用小,疗效高的抗癌药物,已成为当前十分重要的领域。三氧化二砷(arsenic trioxide, As2O3)已经应用于治疗复发性急性早幼粒细胞白血病(APL,M3),且疗效显著。但对于三氧化二砷治疗骨肉瘤的研究较少。长春新碱(vincristine,VCR)已经应用于治疗骨肉瘤,但其具体治疗分子机制研究尚少。本实验主要研究三氧化二砷及长春新碱诱导体外骨肉瘤细胞株MG-63凋亡及其诱导细胞凋亡信号转导通路的分子机制,为以后临床用药提供一定的理论依据。方法:将MG-63细胞置于37℃,饱和湿度5%CO2的10%DMEM培养基中常规培养,待细胞进入对数生长期后用于实验。1光镜观察:将不同浓度的三氧化二砷和长春新碱作用于MG-63细胞,在倒置相差显微镜下定时观察细胞的生长情况并照相。2 MTT法:调整细胞浓度为1×105/ml,以每孔100ul培养于96孔培养板中,待细胞进入对数生长期后,用不同浓度三氧化二砷(10、8、6、4μmol/L)和长春新碱(4、2、1、0.5μg/ml)作用不同时间(24h、36h、48h、60h),采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测药物对细胞的生长抑制作用。3流式细胞术:不同浓度三氧化二砷和长春新碱作用36h;对照组(不含药),8μmol/L三氧化二砷作用分别24h、36h、48h和60h ,2μg/ml长春新碱作用作用12h、24h、36h和48h,收集细胞。收集细胞数为(1～5)×106个,胰酶消化后用1%小牛血清终止,500～1000r/min离心5min,弃去上清,3ml PBS洗一次,加入冰预冷的70%的乙醇固定,4℃,1h。离心弃去固定液,PBS洗一次,加入碘化丙锭(Propidium Iodide,PI:50mg/L Trinton X-100 1.0%)4℃避光染色30min,用Epics-XLⅡ型流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期分布,应用软件进行分析。4 Western印迹法观察三氧化二砷及长春新碱作用于人成骨肉瘤细胞MG-63后PCNA、Caspase-3、CyclinD1、CyclinE、Bcl-2、Bax的表达。结果:1倒置相差显微镜下观察可见经三氧化二砷及长春新碱作用MG-63细胞后,细胞随时间的延长,随浓度的增加,开始细胞形状由梭形变为圆形,但细胞膜完整,然后细胞开始皱缩,圆形细胞逐渐增多,细胞贴壁能力减弱,漂浮。随后细胞体积普遍变小,胞质浓缩,细胞形态不规则,胞膜不完整,贴壁细胞少见,最后大部分细胞漂浮,变化更加明显,基本无贴壁细胞。2不同浓度三氧化二砷(10、8、6、4μmol/L)和不同浓度长春新碱(4、2、1、0.5μg/ml)作用MG-63细胞24h、36h、48h、60h,MTT结果显示三氧化二砷和长春新碱均能明显抑制MG-63细胞增殖,并呈剂量和时间依赖性(p<0.05)。3 FCM分析发现,不同浓度三氧化二砷(10、8、6、4μmol/L)处理细胞36h及8μmol/L三氧化二砷处理细胞24h、36h、48h、60h,G0/G1期前面出现凋亡峰,S期细胞所占比例随药物浓度和时间增加呈上升趋势,所占比例最高达81.4%,而G1期所占比例明显减少。不同浓度长春新碱(4、2、1、0.5μg/ml)处理细胞36h及2μg/ml长春新碱处理细胞12h、24h、36h、48h后,G0/G1期前面出现凋亡峰,G2/M期所占比例随药物浓度和时间增加呈上升趋势,最大所占比例为92.5%,而G1期所占比例明显减少。4 western-blotting结果:经三氧化二砷和长春新碱处理过的骨肉瘤细胞与对照组相比均表现出PCNA、CyclinD1、CyclinE和Bcl-2蛋白表达抑制,Bax及Caspase-3蛋白表达增强。结论:1三氧化二砷和长春新碱均有诱导骨肉瘤细胞MG-63凋亡和抑制增殖的作用,且具有时间-剂量依赖关系。随时间延长不同浓度药物对细胞的最终抑制作用一致。低浓度药物作用长时间和高浓度药物作用短时间对细胞抑制作用一致。提示凋亡峰最高时的浓度可能是最适浓度。2长春新碱对骨肉瘤细胞MG-63显示出明显G2/M期阻滞作用,并可诱导其凋亡,且有一定的时间-剂量依赖性。三氧化二砷在细胞增殖周期中将细胞阻滞于S期细胞,从而干扰细胞DNA或蛋白质的合成。3 As2O3及VCR作用于骨肉瘤细胞MG-63后通过抑制Bcl-2蛋白表达而增强Bax及Caspase-3蛋白表达来诱导细胞凋亡。通过抑制CyclinD1及CyclinE蛋白表达来抑制细胞增殖。4三氧化二砷可与长春新碱联合应用治疗骨肉瘤。