第一部分基质硬度调节椎间盘软骨终板细胞钙化及其机制研究目的:椎间盘退变引发多种脊柱疾病,然而其发病机制并不完全清楚。软骨终板钙化是椎间盘退变的使动和促进因素。椎间盘力学环境对于椎间盘退变具有重要作用。然而,基质硬度的改变对于软骨终板钙化的调节及其分子机制目前并不清楚。方法:本实验首先采用原子力显微镜测定不同退变程度软骨终板的基质硬度。并利用聚丙烯酰氨凝胶模拟不同退变软骨终板硬度,研究基质硬度对软骨终板细胞行为及促进钙化的影响。进一步,我们利用miRNA-mRNA共表达分析研究miR-20a高硬度促进软骨终板细胞钙化中的分子机制。利用双荧光素酶报告基因证实miR-20a可以直接靶向ANKH。之后,利用过表达/敲低miR-20a、慢病毒过表达ANKH等手段明确miR-20a/ANKH轴在高硬度促进软骨终板细胞钙化中的关键作用。结果:在本实验中,我们发现软骨终板基质硬度与椎间盘退变等级呈正相关,高硬度(模拟严重退变时的软骨终板基质硬度)促进软骨终板细胞钙化。进一步,我们通过miRNA-mRNA共表达分析随着硬度增加上调miR-20a表达,同时下调ANKH表达。通过双荧光素酶报告基因证实miR-20a直接靶向ANKH 3’-UTR,从而抑制ANKH表达。在高硬度基质上,抑制miR-20a可以显著降低钙沉积和钙化相关基因表达,而过表达miR-20a可以促进钙化形成。在高硬度基质上,利用慢病毒过表达ANKH后可以上调焦磷酸含量同时抑制钙结节的形成。进一步验证体外实验,我们收集了不同退变程度的病人软骨终板组织,证实随着软骨终板的退变,其ANKH表达量下降。结论:在本实验中,我们证实了 miR-20a/ANKH轴在高硬度基质促进软骨终板细胞钙化中的重要作用,提示miR-20a和ANKH可能作为未来治疗椎间盘退变的重要靶点。第二部分髓核祖细胞力学性质与分化能力相关性研究目的:细胞力学特性可以反映出不同的细胞亚群、疾病状态和组织来源等重要的细胞生化表型信息。过去的研究已经证实椎间盘蜕变可以导致细胞行为和分化能力的改变。髓核祖细胞具有多向分化能力,可以用作治疗椎间盘退变的种子细胞。然而,对于髓核祖细胞分化能力和细胞力学特性之间的关系目前还不清楚,这也阻碍了髓核祖细胞进一步的应用。方法:本部分实验中,利用原子力显微镜测定不同单克隆亚群的祖细胞力学特性(弹性模量、松弛模量、瞬时模量和)。并利用三系诱导分化培养基(成骨分化、成软骨分化和成脂分化)对各个单细胞髓核祖细胞克隆群进行诱导分化培养,运用统计学方法对髓核祖细胞力学特性与其分化能力进行相关性分析。结果:我们发现髓核祖细胞的弹性模量、松弛模量和瞬时模量与其成骨分化能力成正相关,髓核祖细胞的表观粘度与其成软骨分化能力成正相关。结论:本实验结果表明髓核祖细胞的力学特性对预测其分化能力,筛选不同祖细胞亚群具有重要作用。提示生物力学特性可被用作筛选干细胞的“Biomarker”,为后续椎间盘组织工程中种子细胞的筛选提供了一种基于细胞力学的方法,可为椎间盘退变的治疗提供分化能力更强的种子细胞亚群。第三部分间充质干细胞通过SDF-1/CXCR4/AKT通路调节髓核细胞力学性质目的:前期研究表明间充质干细胞移植治疗椎间盘退变在缓解和抑制椎间盘退变的病理生理过程中具有显著作用。细胞力学性质在调节细胞-基质相互作用中具有非常重要的作用,尤其是在反应细胞表型和细胞行为中特异性的改变具有重要价值。然而在间充质干细胞和髓核细胞共培养中对髓核细胞力学性质的影响目前还不清楚。方法:实验中使用共培养体系,重点研究髓核细胞的力学性质。利用原子力显微镜对髓核细胞力学性质,包括弹性模量、松弛模量和瞬时模量等进行精确测定。同时利用化学阻断剂或siRNA技术研究相关的信号通路。在测定髓核细胞生物学活性中,主要考虑了细胞增殖和基质基因表达情况的分析。结果:在本实验中,我们证明了共培养间充质干细胞和退变髓核细胞将导致退变髓核细胞的力学性质(弹性模量、松弛模量和瞬时模量)显著降低,同时退变髓核细胞的生物学活性上调,但共培养间充质干细胞和正常髓核细胞,不能观察到此现象。在共培养退变髓核细胞后,间充质干细胞分泌的SDF-1显著增加。利用药物抑制剂AMD3100抑制SDF-1或siRNA敲低CXCR4表达水平后,共培养MSCs使退变髓核细胞力学性质降低,生物学活性上升的现象被抑制,提示SDF-1/CXCR4通路在间充质干细胞调节髓核细胞力学性质中具有重要作用。进一步,我们发现阻断AKT和FAK可以显著减低间充质干细胞或SDF-1重组蛋白诱导的退变髓核细胞力学性质降低。结论:在本实验中,我们证实了间充质干细胞通过SDF/CXCR4/AKT途径调节退变髓核细胞力学特性。以上发现提示了在间充质干细胞治疗退变椎间盘中,间充质干细胞与髓核细胞的cross-talk中调节髓核细胞力学特性的分子机制,为下一步干细胞治疗椎间盘退行性疾病改善椎间盘生物力学环境提供理论支持。