化学发光（Chemiluminescence,CL）是指参与反应的试剂接受化学能,从基态跃迁到激发态,再从激发态回到基态的过程中以光子形式释放能量的现象。化学发光分析法是根据化学发光强度进行定量的分析方法,具有灵敏度高、线性范围宽、仪器设备简单等优点。免疫分析是基于免疫学上抗原-抗体的特异性识别原理进行目标物检测的分析方法。化学发光免疫分析（Chemiluminescence Immunoassay,CLIA）技术将化学发光的高灵敏度和免疫分析的强特异性相结合,已被广泛应用于临床诊断、生物分析、环境分析等领域。目前,CLIA广泛采用酶标记生物识别分子,常用的酶包括过氧化物酶和碱性磷酸酶。其中,以辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase,HRP）的应用最为广泛。然而,天然HRP存在价格昂贵、标记过程复杂、易失活、提取分离难等缺点。因此,寻找能够替代HRP的模拟酶和催化体系是一个具有重要意义的研究领域,已逐渐成为各国学者的研究热点。2007年,阎锡蕴课题组率先报道了四氧化三铁磁性纳米微粒（Magnetic Nanoparticles,MNPs）的拟过氧化物酶活性。他们发现在过氧化氢存在的条件下,四氧化三铁磁性纳米微粒能催化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine,TMB）,邻苯二胺（o-Phenylenediamine,OPD）等酶底物氧化变色。这一发现打开了纳米微粒过氧化物模拟酶研究的大门。各种纳米微粒包括金纳米微粒、银纳米微粒、氧化石墨烯、碳点、氧化锌纳米微粒等均被报道具有拟过氧化物酶活性,能催化鲁米诺（Luminol）体系产生化学发光。纳米微粒过氧化物模拟酶也被应用于葡萄糖、肿瘤标志物、尿酸、谷胱甘肽等的检测。研究表明,纳米微粒过氧化物模拟酶的催化活性受其尺寸大小、表面性质等因素影响。一些具有良好催化活性的纳米微粒在与生物识别分子偶联后均出现催化活性大幅降低的问题,限制了其作为标记物应用于CLIA。针对此问题,本论文利用亚铁氰化钾能与四氧化三铁磁性纳米微粒反应生成具有拟过氧化物酶活性普鲁士蓝（文献已有报道）的这一特点,提出了一种基于原位生成普鲁士蓝（Prussian Blue,PB）的化学发光免疫分析方法。我们将生物识别分子与磁性纳米微粒偶联,直接以磁性纳米微粒为标记物,在免疫反应结束后,加入亚铁氰化钾原位生成普鲁士蓝,高效催化luminol反应产生化学发光,间接实现目标分析物的定量。论文主要研究内容详述如下:在第一章中,我们采用羧基修饰磁性纳米微粒（COOH-MNPs）,验证了磁性纳米微粒原位生成普鲁士蓝催化luminol体系产生化学发光的可行性。将50μM K₄Fe（CN）₆和100μM鲁米诺混合后,几乎没有信号,表明K₄Fe（CN）₆对luminol无氧化作用;COOH-MNPs自身能催化luminol氧化产生微弱的化学发光信号;当COOH-MNPs与K₄Fe（CN）₆反应40分钟后,与luminol反应的信号则增强了约22倍。目前已有文献报道,Fe³⁺和K₄Fe（CN）₆反应可生成普鲁士蓝,且普鲁士蓝具有良好的拟过氧化物酶活性。除此之外,普鲁士蓝也具有增强磁性纳米微粒拟过氧化物模酶活性的性质。因此,我们推测K₄Fe（CN）₆与磁性纳米微粒反应生成了普鲁士蓝或负载普鲁士蓝的磁性纳米微粒,导致化学发光信号大幅增强。普鲁士蓝是一种蓝色的方形晶体,氰基官能团也有明显的红外吸收峰。因此,我们采用紫外光谱（Ultraviolet Visible Spectra,UV-Vis）,红外光谱（Fourier Transform Infrared Spectra,FT-IR）和TEM（Transmission Electron Microscope,TEM）进行了验证。UV-Vis光谱显示磁性纳米微粒与K₄Fe（CN）₆反应后,溶液在740 nm处出现了新的吸收峰,这与普鲁士蓝的紫外可见吸收峰相吻合。FT-IR光谱显示K₄Fe（CN）₆与磁性纳米微粒反应后其氰基中的碳-氮三键峰由2043 cm^-1处位移到了2089 cm^-1,表明反应生成了普鲁士蓝。其次,K₄Fe（CN）₆在417 cm^-1处的亚铁-氮单键峰也位移到了503 cm^-1,这归属于普鲁士蓝的铁-氮单键峰。此外,TEM图谱显示,磁性纳米微粒与K₄Fe（CN）₆反应后,其表面和溶液中出现许多方形晶体,这表明K₄Fe（CN）₆与磁性纳米微粒反应后生成的普鲁士蓝既存在于磁性纳米微粒表面,也存在于溶液中。以上工作初步验证了磁性纳米微粒能与K₄Fe（CN）₆反应生成普鲁士蓝和负载普鲁士蓝的磁性纳米微粒,其催化luminol反应产生增强的化学发光信号。之后,我们探索了K₄Fe（CN）₆介导的luminol-MNPs化学发光反应的机理。化学发光光谱显示此反应的最大发射波长仍位于约425 nm处,表明反应体系的发光体仍然是激发态3-氨基邻苯二甲酸阴离子（3-aminophthalate*,3-APA*）。发光底物luminol被氧化生成3-APA*产生化学发光,此过程需含氧自由基参与。我们采用自由基清除实验研究了参与反应的含氧自由基种类。首先,我们考察了超氧阴离子自由基(O₂^·-)清除剂对化学发光强度的影响。当加入10 U的超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase,SOD）时,化学发光强度淬灭约87.4%,表明O₂^·-参与了此化学发光反应。O₂^·-可能是从溶解氧转化而来,我们采用氮气吹扫反应溶液40分钟,测定得到的CL信号强度下降了69.1%。生成的O₂^·-在溶液中不稳定,可迅速转化为单线态氧（¹O₂）和H₂O₂。为验证反应中存在¹O₂,我们向反应体系中加入了5 m M组氨酸（单线态氧清除剂）时,99.5%的化学发光强度被抑制。除此之外,18 U过氧化氢酶（Catalase,CAT）能淬灭28.2%的化学发光信号,表明反应过程中确实有H₂O₂的参与。生成的H₂O₂可进一步与Fe²⁺反应（芬顿反应）形成羟基自由基（·OH）。我们将·OH清除剂甲醇、乙醇、DMSO分别加入到该化学发光体系中,约有40%-50%的化学发光强度被抑制。综上,K₄Fe（CN）₆介导的luminol-MNPs化学发光反应可能的机理是:K₄Fe（CN）₆能与磁性纳米微粒反应生成普鲁士蓝,普鲁士蓝能催化溶解氧生成O₂^·-,生成的O₂^·-在溶液中不稳定,可迅速转化为¹O₂和H₂O₂,H₂O₂可进一步与Fe²⁺反应生成·OH。生成的O₂^·-、·OH和¹O₂与鲁米诺自由基反应形成3-APA*。当3-APA*返回基态时,产生增强的化学发光信号。机理研究之后,我们以催化产生的化学发光强度为指标,对反应条件进行了优化。最终选定的实验条件为:K₄Fe（CN）₆浓度为50μM,反应的酸浓度为5 m M,反应时间为40 min,鲁米诺浓度为100μM,鲁米诺稀释液的p H为12。在优化的实验条件下,我们测定了不同浓度COOH-MNPs产生的化学发光强度,结果显示,在0.0046-0.75μg m L^-1范围内,随着MNPs浓度的增加,化学发光强度呈线性上升,两者线性关系良好,对COOH-MNPs的检测限为0.0011μg m L^-1。之后,我们将链霉亲和素（Streptavidin,SA）修饰于COOH-MNPs表面,制备了链霉亲和素修饰的MNPs（SA-MNPs）。我们也测定了不同浓度SA-MNPs产生的化学发光强度。对SA-MNPs的检测限为0.0014μg m L^-1。以上实验结果表明,生物分子修饰对原位生成普鲁士蓝几乎无影响,生成的普鲁士蓝仍具有良好的催化活性,这为构建基于原位生成普鲁士蓝的CLIA法奠定了良好的基础。在第三章中,我们提出构建基于原位生成普鲁士蓝的CLIA法测定兔Ig G（Rabbit Ig G,r Ig G）。以96孔板为载体,将一抗吸附于96孔板表面,分别与兔Ig G和生物素化的二抗反应后形成三明治式的免疫复合物,SA-MNPs通过生物素-链霉亲和素反应结合于96孔板表面,与K₄Fe（CN）₆反应后原位生成普鲁士蓝,高效催化鲁米诺反应产生化学发光,间接实现目标分析物兔Ig G的定量。兔Ig G浓度在0.625-20 ng m L^-1的范围内与化学发光强度成良好的线性关系,线性回归方程为I=0.0811 C+0.333（R²=0.9748）,测定兔Ig G的检测限为0.59 ng m L^-1。我们将所建立方法与经典的酶联免疫吸附实验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA）进行了比较。ELISA法采用SA-HRP为标记,其他的免疫反应试剂与CLIA法相同。采用ELISA法测定兔Ig G的线性范围为1.25-20 ng m L^-1,检测限为0.9 ng m L^-1。结果表明,CLIA法具有与ELISA法相似的线性范围和检测限。为考察所建立方法的重现性,我们对10 ng m L^-1兔Ig G重复测定了7次,所得结果的相对标准偏差为6.8%,表明所建立的CLIA法重现性良好。为考察所建立方法测定兔Ig G的特异性,我们将兔Ig G的浓度设定为10 ng m L^-1,考察了高于其浓度多倍的干扰物质如SA,人Ig G,牛血清白蛋白,血红素,天冬氨酸,甘氨酸对测定的影响。结果表明,只有兔Ig G产生化学发光信号,其他干扰物质的信号均与空白信号相当。之后,我们采用标准加入法考察了所建立CLIA法测定血清兔Ig G的准确性。我们采用人血清考察了血清基质对兔Ig G检测的影响,结果表明50倍稀释的人血清对测定无影响。5,10和20 ng m L^-1的兔Ig G被分别加入50倍稀释的人血清中,并采用所建立的CLIA法进行测定,回收率分别为115.0%?7.4%,90.9%?20.5%,和80.0%?0.9%。除此之外,我们分别采用所建立的CLIA法和ELISA法测定了兔血清中的兔Ig G。采用ELISA法测得兔血清中兔Ig G浓度为1.51?0.37 mg m L^-1,采用CLIA法的结果为1.43?0.14 mg m L^-1,两种方法的测定结果一致,表明所建立的CLIA法可应用于真实血样的检测。为验证此基于原位生成普鲁士蓝的CLIA法可应用于其他蛋白质的测定,我们将该法应用于了癌胚抗原（Carcino-Embryonic Antigen,CEA）的检测。结果显示,在0.5 ng m L^-1-100 ng m L^-1的范围内,化学发光强度与CEA浓度的对数成良好线性关系,测定CEA的检测限为0.28 ng m L^-1。在第四章中,我们进一步构建了基于原位生成普鲁士蓝的化学发光法测定乙型肝炎病毒相关特定序列DNA。将捕获探针固定于96孔板表面,分别与目标DNA和生物素化的报告探针杂交形成三明治式的杂交复合物,SA-MNPs通过生物素-链霉亲和素反应结合于96孔板表面,与K₄Fe（CN）₆反应后原位生成普鲁士蓝,高效催化luminol反应产生化学发光,间接实现目标DNA的定量。结果显示,当目标DNA的量在0.065-1.0 pmol之间时,化学发光强度与DNA的量成良好线性关系,线性回归方程为I=5.4 C+3.488（R²=0.9921）,检测限为0.044 pmol。综上,本论文利用K₄Fe（CN）₆与磁性纳米微粒反应生成普鲁士蓝,建立了其催化的luminol化学发光反应。在此基础上,以磁性纳米微粒为标记物,构建了基于原位生成普鲁士蓝的CLIA法测定兔Ig G和CEA,并将此体系扩展到了特定序列DNA的检测。此方法有以下优点:第一,磁性纳米微粒的制备技术成熟,且商品化程度高,为方法的进一步推广奠定了基础;第二,磁性纳米微粒具有性质稳定、与生物识别分子偶联方法简单、磁性分离方便等优点;第三,在生物识别反应结束后,原位生成普鲁士蓝构建化学发光生物分析方法,避免了纳米微粒拟过氧化物酶与生物识别分子偶联后催化活性降低的问题;第四,所建立的方法能很容易拓宽至其它蛋白质生物大分子、肿瘤细胞、特定DNA、RNA、或是小分子的检测,具有广泛的应用价值。