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水稻是世界上种植范围最广泛、最重要的粮食作物之一,也是研究单子叶植物发育生物学的理想模式植物。突变体是对水稻发育过程各种生化代谢途径及基因功能研究的主要材料,也是水稻优异种质发掘创新、新品种选育的重要资源。对水稻突变体的研究无论在机理探讨还是育种实践上都具有重要的意义。
本研究通过图位克隆的方法从水稻空间诱变突变体HFA-1中分离了一个水稻叶色白化转绿基因hw-1(t),在进行突变体形态学和生理学鉴定的基础上,对该基因的遗传方式、序列结构及表达模式进行了分析。主要结果如下:
1.HFA-1突变体的形态学和生理学鉴定
HFA-1突变体的叶色突变表型与种子胚乳内物质无关,而是受自身发育阶段以及外部环境温度、光照强度所调控。在白化时期,HFA-1突变体的叶绿素、类胡萝卜素含量和光合速率均明显低于野生型;但随着植株发育,光合色素含量及光合作用速率恢复至野生型的水平,表明突变体苗期叶色白化是由于光合色素减少所致。
HFA-1突变体植株形态表现为多蘖矮秆,其多蘖表型是由于高节位分蘖芽激活所致,初步鉴定与苗期叶片IAA(吲哚乙酸)含量无关;而矮生性则由节间长度缩短所致,与苗期GA(赤霉素)的合成和信号传导无关。
2.hw-1(t)基因的遗传分析和初步定位
经多代自交种植观察,HFA-1突变体叶色突变表型的遗传与环境因素无关。利用3个正常表型品种分别与HFA-1突变体配制正反交组合,杂交F1代植株表型均正常。杂交F2代出现表型分离,正常型与突变型植株分离比为3:1,表明HFA-1的突变表型受单隐性核基因控制,将该基因暂名为hw-1(t)。
利用水稻SSR和InDel标记分析其中一个F2代分离群体(HFA-1×矮脚南特),将hw-1(t)基因定位在第4染色体长臂InDel标记HW2与HW7之间,遗传距离分别为1.10 cM和0.38 cM。
3.hw-1(t)基因的精细定位和候选基因筛选
构建了亲本遗传背景差异更大的F2代定位群体(HFA-1×02428),利用新合成的InDel标记将hw-1(t)基因定位在标记HW36和HW4之间,遗传距离分别为0.08cM和0.05 cM。通过整合两个作图群体连锁标记结果,最终将突变基因hw-1(t)精细定位在标记HW7和HW36之间,两个标记间的物理距离为24.9 Kb。
利用生物信息学软件RiceGAAS(http://ricegaas.dna.affrc.go.jp)和WoLFPSORT(http://wolfpsort.org/)对hw-1(t)基因所在区域序列进行基因预测和蛋白亚细胞定位预测,共搜索到5个开放阅读框(ORF),其中3个ORF的亚细胞定位明显与叶绿体有关。
4.候选基因的克隆分析和确定
对5个ORF的测序分析结果发现,HFA-1突变体仅在Os04g57320基因位点上存在一个“G→A”的碱基替换,其余4个ORF的序列与野生型一致,而Os04g57320基因编码产物正好定位于叶绿体内。进一步对HFA-1突变体与野生型的Os04g57320基因cDNA进行了测序分析,发现碱基替换存在于该基因的编码区,导致了蛋白翻译的提前终止,从而确定Os04g57320为hw-1(t)的候选基因。
根据酶切位点特性分析,在碱基替换位置上恰好产生一个内切酶BfaⅠ的位点,设计引物扩增基因内部一段约470 bp的序列(包括突变位点),酶切检测突变体及正常表型品种群体,结果表明该突变位点与突变性状完全连锁,验证了Os04g57320即为hw-1(t)的候选基因。
5.hw-1(t)基因的进化与表达分析
hw-1(t)基因的分子进化分析结果表明其可能编码一个交替氧化酶家族(AOX)叶绿体膜蛋白,在水稻基因组中属于单拷贝基因,与已知功能基因AtIM、SIPTOX的编码蛋白氨基酸序列同源度高达81%以上。
采用半定量RT-PCR的方法,检测了hw-1(t)基因的表达情况,发现hw-1(t)基因在水稻各器官、各时期及光/暗条件下皆为组成型表达,但序列结构的改变对其在突变体内的稳态表达产生影响。
6.HFA-1突变体的基因表达谱分析
选取12个参与类胡萝卜素、植物激素(GA、ABA和SL)生物合成基因进行表达分析,发现大部分基因在白化时期突变体体内的表达较低,而在转绿后时期与野生型基因表达量相对接近,表明hw-1(t)的突变不仅抑制了突变体苗期体内的类胡萝卜素合成,而且还对该过程相关多个次生代谢途径也产生调控作用。
通过基因芯片筛选出HFA-1突变体白化转绿过程的差异表达基因,这些差异表达基因涉及的生理过程主集中于光合作用、内源刺激物和抗逆胁迫响应等方面。进一步的通路分析结果显示,差异表达基因涉及光合作用通路最显著且以上调表达为主,推测该通路的细胞色素Cytb6/f蛋白复合体在电子传递和质醌库还原氧化过程中对hw-1(t)起功能替代作用。