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背景:阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是一种中枢神经系统（central nervous system,CNS）退行性病变,以进行性认知功能障碍和行为损害为主要特征,是老年人群中最常见的痴呆症。AD的主要病理特征为β-淀粉样蛋白（amyloid-beta,Aβ）沉积致老年斑（senile plaques,SP）形成,Tau蛋白过度磷酸化致神经元纤维缠结（neurofibrillary tangles,NFT）,神经元丢失和胶质细胞反应性增生。Aβ是SP的主要组成部分,是由β-淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein,APP）切割而成。Aβ可致CNS慢性炎症反应,神经元功能障碍。自噬是Aβ降解的主要途径,对维持CNS内环境稳态至关重要。微管相关蛋白1轻链3B（Microtuble-associated protein 1 light chain 3B,LC3B）参与自噬小体的形成,当发生自噬时其表达量明显增加,是自噬体的特异性标志物。目前对于AD中自噬功能是增强还是下降尚无定论。自噬功能障碍可导致一些异常蛋白质在细胞内聚集,促进细胞凋亡。已知Tau蛋白是微管相关蛋白,参与维持细胞骨架的动态稳定。当Tau蛋白发生过度磷酸化时,其正常的生物活性丧失,在细胞内异常聚集。有研究表明,过度磷酸化的Tau蛋白异常聚集,可导致神经元凋亡,促进神经退行性变。AT-8是常用的反映Tau蛋白磷酸化的实验指标（识别S202/T205磷酸化位点的Tau蛋白）,其表达量的多少可以反映Tau蛋白磷酸化水平的高低。已知caspase-3是细胞凋亡的终末剪切酶,正常情况下以酶原形式（pro-caspase-3）存在于细胞中,无蛋白酶活性。在凋亡信号激活下pro-caspase-3裂解成活性caspase-3,即19KDa和17KDa两种分子量大小的cleaved caspase-3,进而裂解各种细胞底物,执行细胞凋亡。活性caspase-3在细胞凋亡中的作用无可替代,是细胞凋亡的特异标志物。AD中可能存在自噬功能障碍,导致Aβ沉积,Tau蛋白过度磷酸化,细胞凋亡活性增强。已知APP和早老素1（presenilin 1,PS1）双转基因小鼠是研究AD的常用动物模型。因此,本课题组拟以APP/PS1双转基因模型小鼠和BV2小胶质细胞为实验对象,研究AD中自噬和凋亡的变化情况,及两者与Tau蛋白过度磷酸化之间的可能关联。目的:了解AD动物模型和细胞模型中LC3B的表达和caspase-3的激活情况,及两者与AT-8的可能关联,为AD的临床治疗提供新的理论依据和作用靶点。方法:1.动物实验将APP/PS1双转基因小鼠和野生型小鼠杂交繁殖的子鼠在出生后约4-5周剪尾,按照基因组DNA提取试剂盒说明书提取小鼠DNA,普通PCR技术扩增目的片段,琼脂糖凝胶电泳鉴定子鼠的基因型。随机选取3月龄（3M）、9月龄（9M）、17月龄（17M）的APP/PS1双转基因小鼠及同年龄组野生型小鼠各13只（实验用小鼠均为雄性）,其中7只用来制备冰冻切片,6只用来提取脑组织蛋白。免疫组织化学方法检测小鼠脑组织中老年斑的存在情况和小胶质细胞的数量及形态变化,免疫荧光和蛋白免疫印迹（Western-blot）方法检测LC3B、caspase-3和AT-8的蛋白表达量。2.细胞实验BV2小胶质细胞用0μM、5μM、10μM和20μM不同浓度的Aβ1-42分别处理后,5%CO2、37℃条件下培养6h,收集BV2小胶质细胞并提取细胞蛋白,采用Western-blot方法检测LC3B、caspase-3和AT-8的蛋白表达量。3.统计分析实验数据采用SPSS 19.0软件进行统计分析。两组之间比较采用独立样本t检验;多组间比较采用单因素方差分析,以P≤0.05认为差异具有统计学意义。结果:1.动物实验结果1.1与同年龄组野生型小鼠相比,APP/PS1双转基因小鼠脑组织中老年斑的数量明显增多（3M:P≤0.001,9M:P≤0.001,17M:P≤0.001）,面积明显变大（3M:P≤0.001,9M:P≤0.001,17M:P≤0.001）,结果具有统计学差异,而且APP/PS1双转基因小鼠脑组织中老年斑的数量和面积随着年龄的增加而增加;1.2与同年龄组野生型小鼠相比,3月龄APP/PS1双转基因小鼠小胶质细胞的数量与胞体大小无统计学差异（数量:P=0.403,胞体面积:P=0.258）;9月龄和17月龄APP/PS1双转基因小鼠小胶质细胞的数量明显增多（9M:P=0.03,17M:P=0.003）,胞体明显变大（9M:P=0.022,17M:P=0.022）,结果具有统计学差异,而且随着年龄增加,APP/PS1双转基因小鼠中小胶质细胞的数量增多,胞体变大;1.3与同年龄组野生型小鼠相比,3月龄和9月龄APP/PS1双转基因小鼠LC3B的表达量明显增加（3M:P≤0.001,9M:P≤0.001）,17月龄APP/PS1双转基因小鼠LC3B的表达量明显下降（P≤0.01）,结果具有统计学差异;1.4与同年龄组野生型小鼠相比,3月龄APP/PS1双转基因小鼠活性caspase-3的表达量无统计学差异（P>0.05）,9月龄和17月龄APP/PS1双转基因小鼠活性caspase-3的表达量明显增加（9M:P≤0.01,17M:P≤0.01）,结果具有统计学差异,而且随着年龄增加,APP/PS1双转基因小鼠中活性caspase-3的表达量也增加;1.5与同年龄组野生型小鼠相比,3月龄APP/PS1双转基因小鼠AT-8的表达量无统计学差异（P>0.05）,9月龄和17月龄APP/PS1双转基因小鼠AT-8的表达量明显增加（9M:P≤0.001,17M:P≤0.001）,结果具有统计学差异,而且随着年龄增加,APP/PS1双转基因小鼠AT-8的表达量也增加;2.细胞实验结果与空白对照组相比,5μM的Aβ1-42干预BV2细胞后LC3B-II的表达量明显增加（P≤0.001）,结果具有统计学差异,活性caspase-3和AT-8的表达量无统计学差异（P>0.05）;与5μM实验组相比,10μM和20μM实验组中LC3B-II的表达量明显下降（P≤0.001）,活性caspase-3和AT-8的表达量明显增加（活性caspase-3:P≤0.01,AT-8:P≤0.001）,结果具有统计学差异;且LC3B-II的表达量与Aβ1-42浓度呈负相关,活性caspase-3和AT-8的表达量与Aβ1-42浓度呈正相关。结论:AD中,可能由于小胶质细胞自噬功能下降,致Aβ沉积,Tau蛋白磷酸化增加,细胞凋亡活性增强。