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目的:建立检测NK细胞表面免疫球蛋白样受体基因KIR2DS1 mRNA表达水平的荧光定量PCR方法,并评价其性能;利用所建方法分析allo-HSCT中KIR2DS1基因的表达规律,并研究KIR2DS1 mRNA表达水平与aGvHD和复发之间的关系。方法:针对KIR2DS1基因设计特异性引物及探针,构建TaqMan-MGB荧光定量PCR反应体系,并对该实验方法的准确性、重复性、灵敏度及仪器适用范围、技术人员再现性进行性能评价。以72例ALL和AML患者为研究对象,采用所建的RT-PCR方法动态检测供患双方KIR2DS1 mRNA的表达水平;结合供患双方KIR基因分型分析在HSCT后白血病患者体内KIR2DS1表达来源,及KIR2DS1基因在移植后的表达规律,并根据临床随访资料研究KIR2DS1的表达与aGvHD、复发的相关性。结果:1、NK细胞表面受体KIR2DS1 mRNA表达水平检测方法的建立(1)运用PCR-SSO、PCR-SSP两种实验方法筛选出特异性KIR2DS1基因的碱基序列后设计探针及荧光,并应用定量PCR通用反应体系建立荧光定量PCR反应体系。(2)以KIR-SSO基因定性分型法为金标准,通过对35例样本检测,显示RT-PCR方法对KIR2DS1基因阳性及阴性检测率均为100%。(3)在重复性试验中,选取Ct值分别为高、中、低值3个样本的批内、批间CV(%)分别在 0.09%～0.46%、0.71%～1.13%之间。(4)该方法的灵敏度达102copies/μL,且对102copies/μL的3个样本进行5次重复试验的 CV(%)分别为 5.37%、2.71%、5.51%。(5)仪器比对结果显示,参比仪器ABI-7500与实验仪器LC-480之间的拟合直线回归方程为Y=0.9736X+0.118(R2=0.9619)。(6)两名技术人员对10个KIR2DS1基因阳性样本的再现性比对试验结果显示其偏倚(%)均<±5%。2、NK细胞表面受体KIR2DS1 mRNA表达水平检测方法的临床应用价值(1)通过KIR-SSO检测发现,72例患者的KIR基因型在行allo-HSCT后第1个月均转变为供者的KIR基因型,在移植后各月份间,KIR2DS1mRNA表达水平在供者KIR2DS1基因组和供患者KIR2DS1基因组中差异均无统计学意义(P>0.05)。(2)移植当天供者KIR2DS1转录水平为1898.79×104/ABL拷贝数,KIR2DS1 mRNA在KIR2DS1识别组与KIR2DS1未识别组中表达水平分别为:2238.89×104、1683.81 ×104/ABL拷贝数,KIR2DS1 mRNA在两组间的表达差异无统计学意义(P=0.431)。(3)在移植后第 1M、2M、3M、4-6M、7-9M、10-12M 时,KIR2DS1 转录水平在 AML组中分别为:2711.92、2865.93、2663.60、2043.93、1956.50、2160.41 × 104/ABL拷贝数,在 ALL 组分别为:2263.17、2382.20、2607.68、1825.76、2011.68、2183.70×104/ABL拷贝数;ALL患者中KIR2DS1基因在移植后第1M、2M、3M的mRNA表达水平与供者相比,差异具有统计学意义(P=0.028,P=0.034,P=0.034),AML患者中KIR2DS1基因在移植后第1M、2M的mRNA表达水平与供者相比,差异具有统计学意义(P=0.019,P=0.001)。KIR2DS1基因在AML、ALL组中的mRNA表达规律大体一致,在移植后早期1-3个月内均处于高表达水平状态,达到自身最高中位转录水平后开始下降,并最终维持在稍高于移植当天供者转录水平附近。(4)在移植后前3个月内,Ⅱ-Ⅳ度aGvHD组中KIR2DS1mRNA表达水平均低于0-1度aGvHD组,且在移植后第2M时,两组间表达差异具有统计学意义(P=0.014)。(5)在移植后1-3M、4-6M、7-9M,KIR2DSI mRNA表达水平在免疫耐受组中均高于复发组,但两组间差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:建立了 TaqMan-MGB荧光定量PCR检测KIR2DS1基因mRNA转录水平表达的实验方法,并应用于研究在HSCT后KIR2DS1的表达水平呈动态变化的规律。在HSCT后KIR2DS1 mRNA转录水平的低表达与Ⅱ-Ⅳ度aGvHD的发生相关,为临床采用KIR2DS1基因定量检测作为GvHD诊断指标奠定了实验基础。