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酿酒酵母一直被用来制造对人类有益的代谢产物,并且近年来发现酵母来源的葡聚糖具有提高动物免疫力的作用。酿酒酵母有两种形态:营养形态和子囊包裹的孢子形态。酵母子囊孢子壁的结构与营养态细胞不同,其最外层是二酪氨酸层,次外层是壳聚糖,内层是葡聚糖层,最内层是甘露糖层;而酵母营养态细胞壁最外层是甘露糖蛋白,内层是葡聚糖,最内层是几丁质层。酿酒酵母来源的葡聚糖(Zymosan)是一种碱不溶性的β-1,3键和β-1,6键连接的葡聚糖高聚物,能够被巨噬细胞识别和吞噬,并且能够增强动物免疫力,刺激细胞因子产生,抗病毒抗肿瘤抗感染等作用,还具有抑菌的作用。酵母chs3Δ突变体的孢子壁的壳聚糖层合成缺陷从而暴露葡聚糖层,设计利用chs3Δ作为葡聚糖微球检测其免疫性;酵母dit1Δ突变体孢子壁的二酪氨酸层合成缺陷从而暴露壳聚糖层,壳聚糖是由氨基多糖组成的,其具有免疫佐剂的作用,具有良好的生物相容性,具有抗菌消炎的作用,同时也能刺激增强免疫反应。因此本研究利用chs3Δ突变体孢子作为葡聚糖球,dit1Δ突变体作为壳聚糖球,并且检测其与酵母野生型孢子,营养态酵母对巨噬细胞刺激作用,我们发现野生型孢子,dit1Δ,chs3Δ和营养态酵母都能刺激巨噬细胞产细胞因子TNF-a,IL-12等,本研究发现酵母野生型孢子的吞噬效率远远高于其他突变体孢子以及酵母营养细胞,对于这种现象我们进行了探究。巨噬细胞对微生物的识别依赖于其表面的模式识别受体(pattern recognition receptors,,PRRs)识别微生物表面的分子模式(microbe associated molecular patterns,MAMPs)。巨噬细胞对酵母孢子的高效吞噬是基于其表面特殊的分子结构,酵母孢子最外层的二酪氨酸层结构是野生型酵母孢子特有,而营养态酵母和dit1Δ,chs3Δ突变体酵母孢子不存在的。基于巨噬细胞高效内吞野生型酵母孢子(AN120孢子)这个现象,本研究探究了巨噬细胞识别酵母野生型孢子的配体和受体以及信号通路。当巨噬细胞受体识别配体之后受体被激活,招募脾酪氨酸激酶(Spleen tyrosine kinase,Syk)到免疫受体酪氨酸活化基序(Immunoreceptor tyrosine-based activation motif,ITAM)从而激活下游信号使肌动蛋白重聚形成吞噬体;巨噬细胞也能通过巨胞饮摄入物质,巨胞饮过程与吞噬过程的区别在于:巨胞饮不依赖于磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphoinositide 3-kinases,PI3K)形成内吞体;受体介导的吞噬依赖于PI3K引起肌动蛋白重塑和形成吞噬体。本研究主要内容如下:(1)酿酒酵母孢子的吞噬位点肌动蛋白重塑和聚合,并且这种吞噬能够被SYK和PI3K抑制剂抑制,这表明酵母孢子被巨噬细胞摄入是受体介导的吞噬过程。(2)为了探究巨噬细胞识别酵母孢子表面分子配体,通过单糖和多糖抑制实验,发现葡聚糖特异性抑制营养态酵母的吞噬而不影响酵母孢子的吞噬,这表明巨噬细胞识别酵母孢子的分子机制与营养态细胞不同;发现含有二酪氨酸层的孢子吞噬效率高于二酪氨酸缺陷型的孢子,并且含有二酪氨酸的chs3Δ和osw2Δ子囊裂解液能够抑制野生型酵母孢子的吞噬,这表明了二酪氨酸对于酵母孢子的吞噬是必须的;(3)通过纯化野生型酵母孢子和营养态酵母吞噬体,对比其中富集的蛋白并分析可能的受体。敲除巨噬细胞受体基因,比较吞噬效率发现:敲除RAW264.7巨噬细胞细胞上MAC-1受体的α链基因(ITGAM)或者β链基因(ITGB2)的细胞系均能导致吞噬孢子缺陷,因此推测MAC-1可能是介导孢子吞噬。(4)过量表达酵母孢子吞噬体中富集到的小GTP酶活性突变体发现,RAP1A持续性活性突变能够促进巨噬细胞吞噬孢子,此突变对营养态酵母的吞噬无显著影响;RAP1A无活性突变能够抑制酵母孢子的吞噬,这与之前报道的RAP1A介导MAC-1吞噬的表型一致。综上所述,本研究首次详细的研究了小鼠巨噬细胞对酵母孢子的吞噬,同时也为更深入了解酵母免疫性做了基础研究,并且发现了MAC-1能够介导酵母孢子的吞噬,并且RAP1A能特异性的够调节酵母孢子的吞噬。