论文部分内容阅读
异喹啉生物碱(IQAs)是一类具有重要药理作用的次生代谢产物,主要存在于罂粟科、毛茛科、木兰科、小檗科以及马兜铃科的植物中。如小檗碱具有抗菌,消炎,抗病毒,抗高血糖等功效;血根碱是良好的抗菌消炎药剂;罂粟碱是一种肌肉松弛剂;吗啡和可待因是很好的止痛药。异喹啉生物碱的合成由氨基酸起始,如小檗碱、血根碱、非洲防己碱、巴马丁以及木兰花碱等均由酪氨酸经多种酶催化形成。另外,转录因子也是调控异喹啉生物碱合成的一类关键调控基因,其主要功能是与合成路径中的关键酶结合,通过影响酶的表达量,调控异喹啉生物碱合成量。前人研究发现CjWRKY1,CjbHLH1,EcbHLH1-1和EcbHLH1-2等转录因子均参与了相关生物合成。目前异喹啉生物碱合成路径的主要研究对象为罂粟科植物,而毛茛科植物中异喹啉生物碱合成途径的研究较少。味连(Coptis chinensis Franch.)和云连(C.teeta Wall.)均属于毛茛科植物,同时也是我国重要的药用植物资源,两者中含有多种异喹啉生物碱,其中小檗碱,非洲防己碱,巴马丁和木兰花碱合成路径已知,而黄连碱,表小檗碱和药根碱的路径尚不明确,两种黄连都是研究异喹啉生物碱生物合成途径及黄连属物种间差异的优良材料。另外,两种黄连的形态和生物碱含量均存在差异,利用转录组数据筛选种间的差异性SSR标记鲜有研究。本实验使用Illumina高通量测序技术,对味连和云连的叶片和根的转录组进行测序,对所得的大量转录组数据进行公共数据库序列比对、功能注释及比较转录组分析,并从中筛选出大量异喹啉生物碱生物合成相关基因和功能性SSR。本文的研究将为黄连的选择性育种、药效成分生物合成相关研究提供重要的生物信息数据。主要研究结果如下:1.HPLC在两种黄连的根与叶中共检测到小檗碱、黄连碱、巴马丁、表小檗碱以及药根碱等5种异喹啉生物碱,而且叶片中生物碱含量均低于根中,且味连根中黄连碱,巴马丁,表小檗碱的含量明显高于云连。2.使用Illumina HiSeqTM2000高通量测序平台对味连和云连的叶片和根转录组测序。从云连样品中获得84,199,094条clean reads。从味连样品中获得95,053,646条clean reads。使用短序列组装软件Trinity对clean reads数据从头组装,,从云连样品中获得49,741条unigenes,N50为1,310 nt。味连样品中获得55,903条unigenes,N50为1,306 nt。将拼接所得unigenes与Nr、Swiss-Prot、COG及KEGG数据库进行比对,云连样品中有57.20%的unigenes获得注释信息,味连样品中有53.33%的unigenes获得注释信息。3.在云连和味连的转录组数据库中找到了大部分参与异喹啉生物碱生物合成的酶基因。通过数据分析,最终从云连中发现78条unigenes,味连中发现87条unigenes的功能注释到生物合成关键酶。其中,云连中的78条unigenes均为已知路径中的关键酶候选基因,而味连中86条为已知的,1条为推测路径中关键酶候选基因。通过BLAST比对,我们进一步筛选出Ct0017663,Cc0020654,Ct0000676和Ct0033162可能为CFS,(S)-cheilanthifoline synthase紫堇碱合酶和SPS,(S)-stylopine synthase刺罂粟碱合酶的候选基因,这两种酶是我们推测的合成表小檗碱和黄连碱的关键酶。另外,这两种异喹啉生物碱的生物合成途径未知,本次实验,我们根据已知的路径,推断了黄连碱和表小檗碱的合成路径并且从转录组数据中筛选到了相关酶的候选基因,进一步完善了异喹啉生物碱生物合成的相关信息。4.两种黄连根中生物碱含量均高于叶片,通过比较转录组分析,观察两种黄连中找到的相关酶基因在叶片和根中的表达量差异,发现这些相关酶的候选基因大多数在两种黄连根中的表达量大于叶片,从分子的层面解释了含量的差异,也从侧面说明本次试验中获得的关键酶候选基因具有一定的准确性。5.转录因子可能对异喹啉生物碱生物合成起到调控的作用,本次实验得到CjWRKY1,CjbHLH1,EcbHLH1-1和EcbHLH1-2转录因子的同源基因。通过差异表达以及聚类分析,最终确定了云连中Ct0005642为CjWRKY1转录因子的候选基因;而味连中的Cc0023994则为CjbHLH1的候选基因。两种黄连中,并未发现与EcbHLH1-1和EcbHLH1-2转录因子高度同源的基因。6.本研究通过对两种黄连转录组中SSR位点信息的分析,设计SSR引物,为开发新的SSR标记奠定了基础。利用MISA工具筛选味连及云连转录组测序获得的55,903和49,741条unigenes,对其SSR位点信息进行了分析;Primer3设计SSR引物,随机选取60对引物对两种黄连,每种20株,共40株进行多态性扩增分析。味连和云连转录组分别搜索到4,071和4,041个SSR位点。两种黄连中二核苷酸和三核苷酸重复皆是主要的类型,分别占总SSR的87.71%和87.58%。味连中,二核苷酸重复基元出现最多的为AG/CT,共953个,占总SSR的23.40%,三核苷酸重复基元出现最多的为AAG/CTT,共746个,占总SSR的18.3%;在云连中,AG/CT和AAG/CTT分别为934(23.10%)和773(19.10%)。随机选取60对引物进行PCR扩增,其中12对(20.00%)表现出多态性差异。利用Populations软件作图,将40个材料分为2类。两种黄连转录组中SSR位点出现频率高,类型丰富;大量的SSR为其遗传多样性分析和遗传图谱构建提供了丰富的候选分子标记。