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脂肪氧合酶(Lipoxygenase, EC1.13.11.12, LOX)是一类含有非血红素铁，能够专一催化氧化含有cis,cis-1,4-戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸，形成具有共轭双键的脂肪酸氢过氧化物。LOX在食品工业、医药工业和化工领域具有广泛的应用，市场需求巨大。因此，LOX的生产在国内外受到高度关注。真核LOX相关研究较多，但至今未实现工业化生产，主要原因是真核LOX稳定性较差且难以在异源宿主中分泌表达。目前，国内外对于细菌LOX分泌表达与分子改造的研究报道较少，本文将来源于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的LOX基因在大肠杆菌(Escherichia coli) Rosetta (DE3)中进行分泌表达，并对重组酶进行了性质分析和热稳定性改造。主要结果如下：(1) P. aeruginosa LOX在E. coli中的分泌表达和发酵优化基于NCBI数据库信息，通过PCR克隆得到P. aeruginosa LOX基因。将上述带有天然信号肽的LOX基因克隆至表达载体pET-22b(+)，并在E. coli中分泌表达。确定重组菌摇瓶发酵的较优条件为：TB培养基(诱导时添加0.5%(v/v)吐温-20)、1mmol/L诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、诱导起始菌体密度(OD600)0.6、20℃诱导。重组菌在该条件下诱导50h，胞外酶活达到8.5U/mL。确定重组菌3L罐发酵的较优条件为：TB培养基(诱导时添加0.5%(w/v)SDS)、1mmol/L IPTG、20℃诱导、诱导起始菌体密度(OD600)8。在该条件下诱导48h，胞外酶活可以达到8.0U/mL。这是目前发酵法生产LOX的胞外最高产量。(2)重组LOX的分离纯化和酶学性质分析依次经过硫酸铵沉淀、透析、Q Sepharose High Performance阴离子交换色谱、MonoQ阴离子交换色谱，从重组E. coli发酵液中纯化得到电泳纯的LOX，比酶活由2.1U/mg提高至28.3U/mg，纯化倍数为13.5，回收率为10%。重组LOX的最适反应温度为25℃，在50℃、60℃下酶活半衰期分别为10min和4.5min；最适反应pH为7.5，在pH6.5-7.5范围内能够保持80%以上的酶活；其Km和Kcat值分别为48.9μmol/L和23.51/s；常见二价金属离子对酶活均有不同程度的抑制作用，但二十碳四烯酸(ETYA)对酶活没有任何影响；重组LOX催化氧化亚油酸产生的脂肪酸氢过氧化物(HPOD)中主要成分为13(S)-HPOD。(3)缺失N末端高柔性loop提高LOX热稳定性通过分段缺失重组LOX N端高柔性区域，在未影响催化效率的前提下提高了酶的热稳定性。其中，缺失N端前10个氨基酸对酶学性质没有显著影响，但进一步缺失前20和30个氨基酸可使LOX在50℃下的半衰期分别提高1.3倍和2.1倍，同时比酶活保持了90%以上。而进一步缺失N末端氨基酸会导致重组酶形成包涵体，表明Ile49和Leu59之间的10个氨基酸是LOX在E. coli中正确折叠所必须的。圆二色谱及荧光光谱分析表明，所有突变体的二级、三级结构都没有明显的变化，但表面疏水性均有所降低，这可能也是突变体D20，D30比酶活降低、热稳定性提高的原因之一。(4)改造分子内部高柔性loop提高LOX热稳定性分别通过突变、替换和缺失等策略降低“盖子”结构铰链loop的柔性，以提高LOX热稳定性。其中，将Gly201、Gly206分别及同时突变为Pro使重组LOX在50℃下的半衰期分别提高了0.4、0.6和1.0倍；用PT linker替换L6loop，使得LOX在50℃下的半衰期提高了3.5倍；上述突变体比酶活均保持在85%以上。但缺失L6loop使得LOX的比酶活和热定性分别降低了94%和75%。圆二色谱及荧光光谱分析表明，所有突变体的二级、三级结构均没有明显变化。表面疏水性分析显示，缺失L6loop的突变体表面疏水性增加了1.8倍，可能的原因是L6loop的缺失使LOX疏水的底物结合区域暴露；而其它突变体的表面疏水性则略有降低。(5) N末端融合表达自组装双亲短肽(SAP)提高LOX热稳定性和催化效率通过在LOX N末端融合6种不同SAP，显著提高了LOX的热稳定性和比酶活。其中，APLOX-1和APLOX-6在50℃下的半衰期约为野生酶的3.5倍，而APLOX-2、APLOX-3、APLOX-4和APLOX-5在50℃下的半衰期约为野生酶的4.5倍。此外，SAP-LOX融合蛋白的比酶活分别为野生酶的2.8-1.3倍，其中APLOX-1比酶活最高，达到了81.8U/mg。圆二色谱及荧光光谱分析表明，所有突变体的二级和三级结构都没有发生明显的变化，但表面疏水性都高于野生酶。蛋白质粒径分析显示，融合SAPs使所有融合蛋白的粒径有所增加。这可能是由于SAPs的疏水性使得SAP-LOX融合蛋白单体间的相互作用增强，发生了一定程度寡聚，从而导致其热稳定性增强。此外，分子动力学模拟发现，SAP自身的柔性可能也是影响SAP-LOX融合蛋白热稳定性的一个重要因素。这是国内外首次报道通过融合SAP提高酶的热稳定性和催化活性。