【研究背景】过敏性哮喘是一种常见的慢性呼吸系统疾病，常常表现为反复发作的可逆的支气管阻滞和炎症。该病往往在患者童年即出现症状，其形成一般经历致敏期、潜伏期和激活期三个阶段。过敏性哮喘的发生与患者遗传背景存在高度相关。因此，确定可以影响过敏性哮喘发病的各个阶段的蛋白，将有助于了解过敏性哮喘发生的机制和发展针对性的治疗措施。实际上，越来越多的研究表明，不少基因的改变，会增加患哮喘的风险。这些基因往往涉及调控呼吸道上皮细胞对外界刺激反应的敏感性（例如病毒和细菌感染，环境颗粒刺激等），或者调控免疫系统对致敏原的反应敏感性。骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic Proteins，BMPs)是一组分泌型的多功能肽类生长因子，为转化生长因子TGF-β家族中最大的亚群（其它亚群包括TGF-β和activin）。除BMPl外，其余成员均在结构上与TGF-β相似。BMPs以前体蛋白形式被合成，当被剪切为有活性的成熟体BMPs并分泌至胞后，以同型或异型二聚体形式与2种丝氨酸-苏氨酸激酶受体（BMPR-I和BMPR-II）结合发挥生物学作用，最终参与基因的转录调控。BMPs在组织再生和修复中发挥着重要作用，能够影响多种细胞的增殖、分化、迁移和凋亡。BMP4是BMPs亚型中重要的分子之一，在内皮细胞、平滑肌细胞和上皮细胞等皆有表达。BMP-4在胚胎肺发育中起关键作用。近年来越来越多的报道认为BMP4参与了炎症反应的调控。人类哮喘病人气道上皮组织BMP7的表达升高，表明BMPs家族可能参与调控哮喘中肺部炎症的发生。然而，至少一则报道认为，在以卵清蛋白诱导的小鼠过敏性气道炎症模型中，虽然气道上皮细胞出现BMP信号活化、BMPR-I表达明显增加，肺组织中BMP2和BMP6显著上调，而BMP4却呈现下降。但针对哮喘病人的临床研究表明，气道上皮细胞中的BMP4在哮喘患者和正常人之间没有区别。因此，目前关于BMP4在过敏性哮喘中的表达情况及功能仍然存在争议。除了分泌型蛋白可能参与调控哮喘的发生，铆定在细胞表面的蛋白也可能参与调控过敏性哮喘。粘蛋白1（Mucin1，Muc1）是一种主要分布在腺上皮细胞顶部，以及部分免疫细胞包括T细胞表面的跨膜蛋白，由胞外区（EC区）、跨膜区和胞内区（CT区）构成。其CT区分布有酪氨酸磷酸化位点、GSK3β结合位点和β-catenin结合位点。这些位点的磷酸化或和配体结合，可以引起下游细胞信号的改变。近年来，MUC1被发现参与了肺部炎症反应的调控。在LPS引起的急性肺部炎症模型中，Muc1缺失小鼠表现出更严重的炎症反应， Muc1起了抑制过度炎症反应的作用。但Muc1在哮喘发生中是否起了变化，以及Muc1在哮喘发生过程中是否有调控作用，都尚未有报道。哮喘动物模型是研究哮喘发生的重要工具。目前应用最广泛的是小鼠哮喘动物模型。虽然哮喘动物模型目前很难完全模拟人类哮喘的全部特点，但某些哮喘的基本特征例如气道炎症、气道高反应性、气道粘液高分泌和气道重塑等都能在小鼠哮喘模型中模拟出来。成功的哮喘动物模型至少应具备气道炎症和气道高反应性的两个基本特征。【研究目的】通过在BMP4和Muc1基因敲除小鼠上建立哮喘模型，观察BMP4和Muc1蛋白在在哮喘疾病过程中的的变化情况，试图阐明这两种蛋白对哮喘发生的影响及其潜在机制。本研究将对寻找哮喘治疗新的作用靶点具有积极意义。【研究方法】基因鉴定：①、切取部分小鼠尾尖组织，加入裂解液后55℃过夜，以充分裂解小鼠尾巴组织；②、将小鼠尾巴组织裂解液中的DNA提纯；③、以已经提纯的小鼠尾巴组织DNA为模板，进行PCR反应；④、PCR产物经琼脂糖胶电泳后成像。运用不同剂量卵清蛋白（ovalbumin，OVA）致敏和激发小鼠，建立小鼠哮喘模型：①、哮喘动物模型的建立。建模过程分为3个基本阶段：腹腔注射佐剂+致敏原的致敏阶段，1到2周的等待阶段，最后4天连续致敏原滴鼻的激发阶段。等待时间会根据造模小鼠不同遗传背景而做调整。②、小鼠肺功能测定及实验标本的收集。造模结束后，用无创体描仪（plethysmography）法测定小鼠肺功能。随后处死小鼠，收集支气管肺泡灌洗液、血清、肺组织等标本。评估肺组织炎症反应程度：①、统计支气管肺泡灌洗液中分类细胞数及计算其所占比例。②、使用实时定量RT-PCR方法，检测肺组织及支气管肺泡灌洗液总细胞中以下细胞因子的mRNA水平：IL4、IL5、IL17A、IL1β、MCPT-8和CCL-11。③、肺石蜡切片H&E染色观察肺组织炎症反应情况，过碘酸-雪夫染色（PAS染色）观察气道上皮杯状细胞增生及粘液分泌情况。哮喘小鼠模型BMP4及Muc1表达水平检测：①、使用Elisa法，检测血清及支气管肺泡灌洗液中BMP4成熟体蛋白的水平。使用蛋白免疫印迹方法，检测肺组织中BMP4蛋白的表达水平。②、使用实时定量RT-PCR方法，检测肺组织中BMP4和Muc1的表达水平。【实验结果】1、哮喘发生时BMP4蛋白的变化情况及功能。1.1哮喘发生后，肺组织中BMP4蛋白表达保持稳定，但支气管肺泡灌洗液中分泌型BMP4增加。其分泌增加与激发致敏原剂量相关。1.2低剂量致敏原激发的哮喘模型小鼠中，BMP4+/+和BMP4+/-两种小鼠在炎症反应的表型上没有区别。BMP4+/+和BMP4+/-两种小鼠均出现支气管肺泡灌洗液中细胞增多，肺组织炎症细胞浸润等炎症症状，其中主要细胞类型为巨噬细胞和嗜酸性粒细胞，另外还有少量嗜中性粒细胞。肺组织Th2和Th17细胞因子水平上调，但Th1细胞因子水平变化不明显，且在BMP4+/+和BMP4+/-小鼠之间没有显著性差异。1.3仅高剂量致敏原激发处理即可引起BALF中嗜中性粒细胞增加。在腹腔致敏结合高剂量激发引起的哮喘小鼠模型中，与BMP4+/-小鼠相比，BMP4+/+小鼠BAL fluid中出现更严重的巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞增多现象，其肺组织Th1细胞因子IL1β水平更高，同时Th2细胞因子IL4水平相对下调。肺组织Th17细胞因子水平显著上调但在两种小鼠间没有显著性差异。与低剂量致敏原激发的哮喘相比，高剂量致敏原激发的哮喘出现明显的中性粒细胞增多现象，其中BAL fluid嗜中性粒细胞总数在两种小鼠之间的差异比低剂量时更为明显。检查BAL fluid总细胞中炎症因子的表达情况，发现BMP4+/+小鼠IL1β水平比BMP4+/-小鼠高，而IL4、IL17A和CCL11水平低于BMP4+/-小鼠。1.4嗜碱性细胞标志物MCPT-8在该方法引起的哮喘发生前后没有明显变化。2、哮喘发生时Muc1蛋白的变化情况及功能。2.1哮喘发生时，肺组织Muc1水平下调。2.2Muc5ac在哮喘发生时上调，Muc1缺失不影响Muc5ac的上调。2.3接受腹腔致敏的小鼠，肺组织Th1细胞因子IL1β水平下调。仅腹腔致敏不能引起肺部炎症。2.4仅致敏原激发处理不能引起肺部炎症症状。2.5哮喘模型组中，与Muc1-/-小鼠相比，Muc1+/+小鼠出现更严重哮喘症状，包括：①、支气管肺泡灌洗液中总细胞数增加，增加的细胞绝大部分是嗜酸性粒细胞。②、肺组织出现更严重炎症细胞侵润、气道上皮杯状细胞增生和粘液分泌增高。③、肺组织Th2细胞因子IL5和Th17IL细胞因子17A、嗜酸性细胞趋化因子CCL11水平更高。而Th1细胞因子IL1β则呈现下调。【实验结论】1、哮喘发生时BMP4分泌增加，并且与激发哮喘的致敏原剂量相关。2、低剂量致敏原激发的哮喘中，BMP4+/+和BMP4+/-小鼠之间在肺部炎症反应上没有显著性差异。高剂量致敏原激发的哮喘中，与BMP4+/-小鼠比较，BMP4+/+小鼠出现更强的肺部炎症反应，表现为更显著的炎性细胞浸润。与低剂量激发哮喘组相比，高剂量致敏原在BMP4+/+小鼠中引起明显的嗜中性粒细胞增多。提示BMP4蛋白可能在哮喘发病中起调控炎症反应的作用，尤其可能影响多见于重症哮喘的嗜中性粒细胞增多。3、由于哮喘发生时肺组织Muc1表达下调，而Muc1完全缺失的小鼠哮喘症状却更轻，那么Muc1的存在有可能促使了哮喘的发生。肺组织中Muc1下调可能是肺组织Muc1主要来源的气道上皮细胞在炎症发生中受损的结果。4、由于Muc1同时也在T细胞表面表达，并参与调控活化后的T细胞对致敏原的反应。而仅致敏原激发处理并没有引起任何症状，那么，Muc1有可能通过影响腹腔致敏的过程从而影响激发后的肺部炎症反应。