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RNA沉默(RNA silencing)是一种在真核生物体内普遍保守的,发生在RNA水平的,基于核酸序列特异性的相互作用来抑制基因表达的调控机制。在植物中,RNA沉默被认为是植物对抗病毒侵染的防御机制。针对这种防御机制,许多植物病毒已演化通过编码RNA沉默的病毒抑制子(Viral Suppressor of RNA silencing,VSR)来克服这种防御反应。比如,番茄丛矮病毒(Tomato Bushy Stunt Virus,TBSV)p19基因已经被鉴定具有RNA沉默的病毒抑制子活性。黄瓜坏死病毒(Cucumber Necrosis Virus, CNV)是Tombusviridae科Tombusvirus属成员。CNV基因组为正单链RNA(+single-strand RNA,+ssRNA),基因组全长4701bp,含有5个开放阅读框(Open Reading Frame,ORF),其中ORF5编码一个分子量约为20KD的蛋白,即CNV P20。CNV p20基因与TBSV p19基因具有序列同源性,二者的氨基酸同源率为75%,而且编码CNV p20基因与TBSV p19基因的ORF在基因组中具有相似的位置。然而,CNV p20的基因功能目前还不清楚。鉴于此,我们通过病毒诱导的基因沉默(Virus-Induced Gene Silencing,VIGS)体系和农杆菌介导的瞬时表达系统等,对CNV p20在植物内的基因功能进行了系统研究,发现CNV p20在植物体内具有RNA沉默的病毒抑制子活性,但是在农杆菌介导的瞬时表达系统中不能有效抑制RNA沉默。主要研究内容如下:1:利用VIGS系统,采用含有GFP基因的CNV病毒p20基因缺失突变体等侵染GFP转基因烟草16c,通过紫外灯荧光观察发现CNV p20基因缺失突变体侵染的植株发生了GFP本位沉默和系统沉默,而含有CNV p20基因的病毒则有效抑制了GFP的本位沉默和系统沉默。Northern blot分析表明,与对照比较,不含有CNV p20基因的突变体接种的植株中GFP mRNA被降解。进一步分析发现不表达GFP基因的突变体依然可以引致植物的GFP基因沉默,而与CNV p20具有重叠序列的CNV p21并不能抑制GFP基因沉默。这些结果表明在VIGS系统中,CNV p20具有抑制RNA沉默的活性。2:采用农杆菌介导的瞬时表达系统鉴定CNV p20抑制RNA沉默的活性发现,农杆菌介导的CNV p20并不像TBSV p19一样表现出RNA沉默的病毒抑制子活性,而且CNV病毒的其他基因产物也不能协助CNV p20抑制GFP转基因沉默。CNV p20蛋白及mRNA分析表明在农杆菌瞬时表达系统中,CNV p20的mRNA和蛋白均处于较低的表达水平,仅相当于TBSV p19的1/100到1/50。Q-PCR分析表明在接种后第4天起,CNV p20处理的植株中GFP mRNA转录水平远低于TBSV p19,而与GFP基因单独处理的植株相当。通过改变表达载体,氨基酸残基突变等,对CNV p20在农杆菌瞬时表达系统中的蛋白表达帮助不大。尽管如此,与TBSV p19类似,在该系统中CNV p20可以有效促进与其共表达的GFP外部蛋白。这些结果表明CNV p20具有RNA沉默的病毒抑制子活性,并且该活性依赖于CNV p20在植物中的剂量。3:采用CNV野生型和p20基因缺失突变侵染烟草后分析病毒RNA转录水平变化发现,CNV p20可以协助病毒侵染寄主植物,抑制植物对外源病毒RNA的降解。采用等量CNV病毒和TBSV病毒侵染烟草后,对比烟草体内CNV P20和TBSV P19蛋白表达水平发现,在病毒侵染的寄主植物中,CNV P20和TBSV P19具有相似的蛋白表达水平。这些结果表明在CNV病毒侵染植物过程中,CNV p20具有和TBSV p19相似的RNA沉默抑制子活性。4:基于CNV p20与TBSV p19在基因序列和基因功能上的相似性,我们预测并分析了二者所编码蛋白的二级和三级结构。蛋白二级结构分析表明CNV P20与TBSV P19蛋白形成α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲的构像趋势非常接近,二者具有相似的蛋白质二级结构构成。分析蛋白三级结构发现,CNV P20与TBSV P19蛋白单体和蛋白二聚体都具有很高的相似性,二者都折叠形成结合siRNAs分子的爪状结构。对比分析直接结合siRNAs分子的10个氨基酸残基,CNV P20蛋白只有2个位置上的氨基酸残基与TBSV P19不一致。但是发生变化的氨基酸残基,要么不影响其抑制RNA沉默活性,要么可以通过临近氨基酸残基实现对这种结合作用的补偿。由此推测,CNV P20蛋白采取了与TBSV P19蛋白一致,或者近似的方式结合RNA分子,从而抑制由siRNA参与的RNAi过程。