研究背景及目的地中海贫血是全世界的高发遗传病之一,是人体内的α、β-珠蛋白基因突变或者缺失致珠蛋白肽链失衡引起的溶血性贫血。地中海贫血多发于地中海沿岸国家,我国沿海城市是高发地区,特别是广西、广东、海南、台湾和香港等地,人群携带率约10%。地中海贫血尚无根治的方法,只能靠输血治疗或骨髓移植,但其价格昂贵且不能彻底治愈,因此产前筛查和诊断对预防地中海贫血具有重大意义。目前临床报道产前诊断的取材方法有:绒毛活检、羊膜腔穿刺、脐静脉穿刺,这些有创伤性的操作可能导致孕妇出血、流产或宫内感染等。1997年,卢煜明团队发现孕妇外周血浆中存在来自胎儿的游离DNA,这一发现为无创性产前诊断提供了新的思路。随着高通量测序技术的应用,孕妇血浆游离DNA无创产前检测胎儿非整倍体及部分微缺失/微重复综合征已经广泛应用于临床。基于此类胎儿游离DNA的无创产前诊断更安全,更容易被受试者接受,也避免了获取胎儿物质的创伤性操作导致的风险。鉴于此,本研究拟建立一套安全、准确、无创性地中海贫血产前检测方案。方法选取中山大学附属第三医院产前诊断中心8个地中海贫血家系,4个为α-地贫携带家系,4个为β-地贫携带家系。抽取夫妇双方外周血、孕妇羊水标本进行DNA提取,使用多重PCR对家系成员基因组DNA进行扩增,扩增区域为HBA基因及HBB基因上下游2Mb的高频变异单核苷酸多态性位点及致病变异位点。α-地中海贫血扩增引物共1354对,β-地中海贫血扩增引物共361对,扩增产物采用半导体高通量测序及生物信息分析。利用父母亲碱基差异的SNP位点进行分类统计,把致病变异位点与SNP位点关联到同一条染色体上构建单倍体型。采集孕妇外周血、分离血浆及提取血浆游离DNA,优化文库构建及靶向捕获体系,减少孕妇血浆用量。血浆游离DNA进行目标靶向捕获,捕获范围为HBA基因及HBB基因上下游2Mb的高频变异单核苷酸多态性位点及致病变异位点,半导体高通量测序后获得母血浆DNA的SNP位点,生物信息分析胎儿父源性遗传单倍体型及母血中单倍体型相对剂量,将血浆cffDNA中SNP的累积数量输入到序贯分类模型中分类,确定母源性遗传单倍体型,最终获得胎儿地中海贫血基因型。孕妇羊膜腔穿刺获得的羊水DNA进行地中海贫血产前诊断的结果与应用母血浆cffDNA进行地中海贫血无创性产前检测的结果进行比对分析,验证本方案的准确性及可行性。结果1、目标捕获文库浓度大于100pM进行上机测序,数据量可用于生物信息分析,100pM的文库最低血浆量为2ml,全血量为5ml。2、采用父源性母源性碱基差异的SNP位点测序频率计算胎儿浓度,与胎儿Y染色体比例或通过Y染色体拟合计算胎儿浓度趋势一致,差异没有统计学意义(P>0.05)。3、8例进行无创性地中海贫血检测的家系中,成功推导出所有家系的单倍体型。4、8例进行无创性地中海贫血检测的家系中,通过单倍体型分析、单倍型剂量分析、序贯概率比检验成功推导出所有家系的胎儿地中海贫血基因型。5、通过母血浆游离DNA检测的地中海贫血基因型与侵入性产前诊断结果一致,符合率为100%。结论建立了一种基于高通量测序技术的地中海贫血无创性产前筛查方案,使高通量测序在遗传病检测领域中应用更全面,更广泛。该方案具有无创伤性、检出率高、灵敏度高等特点,为临床开展其他单基因病无创性产前检测提供技术基础。