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糖尿病视网膜病变(Diabetic retinopathy,DR)是影响糖尿病人群视力最常见的微血管并发症。持续性高血糖状态下的慢性低度亚临床炎症对视网膜微血管有影响,最终导致DR。一项日本研究表明,15.0%的轻度非增生性DR发展为增生性DR(Proliferative diabetic retinopathy,PDR)。糖尿病病程的增长,严重影响视力的PDR的发病率亦增高。研究DR的具体发病机制,积极寻找降低这种风险的治疗方法至关重要。多项研究表明,炎症介质参与了 DR,炎症细胞产生了血管生长因子,这与DR的发生发展有关。脂质运载蛋白2(Lipocalin-2,LCN2)作为一种新型的脂肪因子,在炎症、肥胖和胰岛素抵抗中具有潜在的作用。视网膜Müller细胞和视网膜色素上皮细胞主要表达LCN2。据报道,血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)可以增强血管内皮细胞迁移力。前期研究中,我们发现LCN2在糖尿病患者血清中浓度增高,LCN2在DR发病中起到的作用尚不明确。本研究目的是评估PDR患者玻璃体中LCN2的表达及进行其相关研究,并进一步在体内外实验中验证LCN2的表达。具体内容如下:第一部分LCN2在PDR患者玻璃体的表达目的:探讨PDR患者玻璃体LCN2的表达,检测PDR玻璃体VEGF的水平。方法:1.67例玻璃体切割术后患者,47例病例组PDR组和20例对照组特发性黄斑裂孔(Idiopathic macular hole,IMH)组,使用酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)测定其玻璃体中 LCN2 和 VEGF 的浓度。2.PDR活动性用于进一步的分组分析,32例活动性PDR和15例非活动性PDR测定其玻璃体LCN2和VEGF的浓度。结果:1.PDR组与IMH组比较,PDR玻璃体LCN2表达水平显著增高(分别为63,522±30,009 pg/ml 与 1663±1191pg/ml;p<0.001)。2.PDR组与IMH组比较,PDR玻璃体VEGF水平明显提升(分别为1038±1326 pg/ml 和 9 pg/ml;p<0.001)。3.非活动性PDR患者玻璃体LCN2的平均表达水平明显低于活动性PDR患者(分别为31,645±11,122pg/ml和 78,465±23,637pg/ml;p<0.001)。4.非活动性PDR玻璃体VEGF的平均水平显著低于活动性PDR(分别为224±69 pg/ml 和 1419.2±1461 pg/ml;p<0.001)。结论:本研究显示LCN2和VEGF表达量在PDR患者玻璃体中显著增加,非活动性PDR玻璃体LCN2和VEGF平均水平明显低于活动性PDR。这些发现表明,LCN2可能参与了 PDR的血管形成。第二部分LCN2和VEGF在PDR患者玻璃体表达的相关研究目的:探讨PDR患者玻璃体LCN2和VEGF表达的相关性,并进一步研究抗VEGF治疗和全视网膜光凝(Panretinal photocoagulation,PRP)后 PDR 玻璃体 LCN2 和 VEGF的水平。方法:1.分析PDR玻璃体LCN2和VEGF表达水平的相关性。47例PDR组按照是否抗VEGF治疗以及是否完全PRP进一步分组分析。2.进一步通过ELISA测定21例未进行抗VEGF的PDR和26例进行抗VEGF的PDR其玻璃体LCN2和VEGF的水平。3.通过ELISA检测19例不完全PRP的PDR玻璃体LCN2和VEGF的浓度与28例完全PRP的PDR玻璃体LCN2和VEGF的浓度。结果:1.Pearson的相关分析表明,PDR患者玻璃体LCN2与VEGF的水平之间有显著相关性(R=0.34;p=0.019)。2.抗VEGF的PDR玻璃体LCN2的平均表达水平高于未进行抗VEGF的PDR患者(分别为 76,286±19,492 pg/ml 与 62,350±24,850 pg/ml;p>0.05),无明显统计学意义。3.完全PRP的PDR玻璃体LCN2的平均水平明显低于不完全PRP的PDR(分别为 37,304±16,651 pg/ml 与 79,796±24,391 pg/ml;p<0.001)。4.完全PRP的PDR玻璃体VEGF的平均浓度显著低于不完全PRP的PDR(分别为 388.83±397.40 pg/ml 与 1440.49± 1534.23 pg/ml;p<0.001)。5.Pearson的相关分析表明,从PRP到玻璃体切割术的持续时间与LCN2或VEGF的玻璃体水平之间无显著相关性(分别为p□=0.139和p□=0.205)。结论:PDR患者玻璃体LCN2和VEGF的浓度之间存在显著相关性,表明LCN2可能与PDR的发病机制有关。完全PRP的PDR患者玻璃体LCN2和VEGF的平均表达水平显著低于不完全PRP的PDR患者,完全PRP对延缓PDR病变进展可能有一定作用。第三部分LCN2参与DR的发病机制目的:通过细胞培养和动物实验探讨LCN2在DR发病中的作用。方法:1.细胞培养选用ARPE19,在不同糖浓度下进行培养。LCN2和VEGF mRNA和蛋白的水平通过蛋白质印迹法(Western blot,WB)和荧光定量PCR(RT-PCR)测定。2.经典的糖尿病大鼠模型,玻璃体注射携带有siLCN2的慢病毒进行干预研究,检测LCN2和VEGF的mRNA和蛋白的表达。3.经典的糖尿病大鼠模型,玻璃体注射携带有siLCN2的慢病毒进行干预研究,检测炎症因子(IL-8,VCAM-1)和凋亡因子(p53,BAX)的表达水平。结果:1.HG组细胞中LCN2和VEGF的mRNA和蛋白量明显提升(p<0.05)。2.DM组较Control组,前者视网膜LCN2和VEGF的mRNA和蛋白量明显提升(p<0.05),DM组与DM+siLCN2组比较,后者视网膜VEGF的mRNA和蛋白量显著降低(p<0.05)。3.与Control组比较,DM组视网膜炎症因子IL-8和VCAM-1的mRNA水平和蛋白水平上均显著提高(p<0.05)。DM+siLCN2组与DM组相比,前者视网膜IL-8的mRNA和蛋白水平有所降低(p>0.05)。DM组与DM+siLCN2组比较,后者视网膜VCAM-1的mRNA和蛋白量显著降低(p<0.05)。4.DM组较Control组,前者视网膜凋亡因子p53和BAX的mRNA和蛋白量明显增加(p<0.05)。DM+siLCN2组与DM组比较,DM+siLCN2组视网膜凋亡因子p53和BAX的mRNA和蛋白表达水平上有所增加(p>0.05)。结论:HG组细胞LCN2和VEGF mRNA和蛋白量明显提升。DM组视网膜LCN2和VEGF的mRNA和蛋白水平显著增高,并且LCN2上调炎性因子VCAM-1的表达,可能促进了视网膜炎症反应。