随着工业水平的提高,人口数量的增长,能源和环境问题成为人类社会生存发展面临的严峻挑战。太阳能是地球上非常重要的能量来源,生物质资源作为固定化的太阳能是地球上最丰富的碳资源来源,可以成为支撑人类社会发展的可再生能源。生物质资源中纤维素所占比例可高达50%,理论上可以成为重要的清洁可再生能源来源。但由于其不溶性以及结晶区的存在,纤维素不容易被降解利用,成为纤维素能源发展的瓶颈。而现有的物理、化学等破坏纤维素结晶区的方法通常能耗较大,而且对坏境的伤害比较大,不符合社会的可持续发展。因此实现纤维素的生物转化成为现阶段的迫切需要。Cytophaga hutchinsonii是广泛分布于土壤中属拟杆菌门的革兰氏阴性细菌,具有很强的纤维素降解能力,在贫瘠条件下可以快速彻底地降解结晶纤维素。C. hutchinsonii没有游离的纤维素酶产生,其纤维素酶都是细胞结合型的,而且在纤维素降解过程中也没有胞外还原糖的积累。基因组序列分析显示C.hutchinsonii也不含编码锚定蛋白或粘附蛋白的基因,而这两者是纤维小体的重要组成。因此,C. hutchinsonii对纤维素的降解既不采取好氧真菌的游离纤维素酶机制也不采取厌氧细菌的纤维小体机制,可能采用一种新型并且未知的纤维素降解机制。对这种纤维素降解机制的研究可能会对实现纤维素的生物转化有一定帮助。而目前为止对C. hutchinsonii的纤维素降解机制了解甚少,其纤维素降解酶大部分也是未知的。通过基因组分析知道C. hutchinsonii中不含编码已知纤维素外切酶的基因,其纤维素酶编码基因中也不含碳水化合物结构域（cabohydrate binding module, CBM）。因而对C. hutchinsonii纤维素酶的研究显得尤为重要,不仅可以帮助了解这种新型的纤维素降解机制,还有可能帮助发现一些新型的纤维素酶,扩大工业用纤维素酶的来源。本文将C. hutchinsonii中预测的多个纤维素酶在Escherichia. coli中进行了表达,对得到活性表达的蛋白进行了性质研究,发现三个新型的纤维素酶。具体研究内容以及取得的结果如下：1.持续性内切纤维素酶CHU₂103的研究持续性纤维素酶一般包括外切纤维素酶和持续性内切纤维素酶,可以持续降解纤维素链产生纤维二糖或纤维寡糖,在结晶纤维素降解过程中起重要作用。C. hutchinsonii基因组分析发现不含编码已知外切纤维素酶的基因,但有两个内切纤维素酶（CHU₁107和CHU₂103）与已知的持续性内切纤维素酶相似性比较高,其中CHU 2103由346个氨基酸残基组成,含有一个糖苷水解酶家族5（Glycoside hydrolase, GH5）的保守结构域,而且与其他GH5家族持续性内切纤维素酶不同,CHU 2103不含有CBM。在E. coli中表达CHU₂103,得到有活性的蛋白,对其性质研究当发现,CHU₂103不仅可以降解羧甲基纤维素（CMC）,还可以降解对硝基苯纤维二糖苷（pNPC）和纤维三糖,而pNPC和纤维三糖一般是外切纤维素酶的底物,不能被内切纤维素酶降解,说明CHU₂103兼具内切纤维素酶和外切纤维素酶活性。CHU 2103降解不溶性纤维素的最终产物是纤维二糖和纤维三糖,并且产生的还原端中约80%来自于可溶性组分,显示CHU 2103可以持续降解纤维素链产生更多的可溶性还原糖。在降解CMC过程中,CHU₂103可以在短时间内大幅降低CMC溶液的黏度,并且反应的最终产物是一系列聚合度不同的纤维寡糖,说明以内切方式降解CMC,结合对不溶性纤维素的降解方式,判断CHU 2103是持续性内切纤维素酶。CHU 2103降解纤维寡糖时终产物中葡萄糖的含量极少,而且在降解pNP-纤维寡糖过程中有更大聚合度的纤维寡糖产生,说明CHU₂103不仅具水解酶活性,也具有转糖基酶活性,可以通过转糖基作用生成更长链的寡糖。与已报道的持续性纤维素酶不同,CHU 2103只含有一个催化结构域（CD）,不含碳水化合物结合结构域（CBM）,而且CHU 2103可以吸附纤维素,说明其纤维素吸附能力存在于催化结构域。对其催化结构域活性位点附近保守氨基酸定点突变,发现197位色氨酸是CHU 2103保持持续性降解和纤维素吸附能力的关键位点,将W197突变为丙氨酸后CHU 2103不能吸附纤维素也失去了持续降解的能力,变为典型的内切纤维素酶。在C. hutchinsonii中通过同源双交换将chu 2103基因敲除后,其在纤维素为唯一碳源培养基上的生长几乎不受影响,而对其细胞表面和细胞裂解液内切纤维素酶活检测发现chu 2103敲除株的活性分别降低35%和25%,说明CHU 2103是C. hutchinsonii细胞表面重要的内切纤维素酶但并不是其降解纤维素过程中关键或必需的纤维素酶。2.Ca2+依赖的持续性内切纤维素酶CHU₁280的研究CHU 1280由571个氨基酸残基组成,含有一个GH9家族保守结构域,不含CBM,与Clostridium. thermocellum中一个外切纤维素酶具有较高的相似性,其序列一致性可达29%。CHU 1280的三维结构与C. thermocellum中CelD相似性极大,并含有两个保守的Ca2+结合位点。在E. coli中表达CHU 1280并得到大量有活性的蛋白,对其性质研究发现CHU 1280在不含Ca2+体系中不表现出任何活性,而在反应体系中加入一定浓度CaCl2后既可以降解CMC也可以降解pNPC,说明其活性是Ca2+依赖的。CHU₁280降解CMC过程中可以迅速降低CMC溶液的黏度,最终产物为一系列聚合度不同的纤维寡糖,而降解不溶性纤维素的最终产物为葡萄糖和纤维二糖,并且产生的还原端中近80%来自于可溶性组分,说明CHU 1280以内切方式降解CMC并且可以持续降解不溶性纤维素,属于持续性内切纤维素酶。CHU 1280对纤维三糖、纤维四糖以及纤维五糖等纤维寡糖也具有降解能力,降解纤维三糖的主要产物是葡萄糖和纤维二糖,降解纤维四糖的主要产物是纤维二糖还有少量的葡萄糖和纤维三糖,降解纤维五糖的主要产物是纤维二糖和纤维三糖还有少量葡糖糖和纤维四糖,说明CHU 1280更倾向于降解糖链内部的糖苷键,也可以从非还原端切下少量的葡萄糖。CHU 1280中不含CBM,但发现其可以吸附纤维素,而且对纤维素的吸附性也是Ca2+依赖,说明Ca2+可以改变CHU 1280的结构,使其具有吸附并且降解纤维素的能力。一般认为现Ca2+促进纤维素酶活力是通过增强酶的稳定性使其活力增大,但通过对CHU 1280稳定性检测发现,以酶活性作为表征时,Ca2+可以使CHU 1280的耐热性提高10℃左右（处理时间为1 h）,而以蛋白微热量变化为表征时,则发现Ca2+使其整体蛋白结构趋于不稳定。说明Ca2+可以稳定CHU 1280活性中心的结构而使其整体结构更加不稳定。3.纤维寡糖酶CHU₂268的研究CHU 2268由758个氨基酸残基组成,含有一个GH3保守结构域,NCBI中注释为GH3家族的p-葡萄糖苷酶。CHU₂268的三维结构与来自大麦的外切水解酶Exo I和来自南极菌Psedoalteromonas的外切β-1,3/1,4-葡聚糖酶Exo P相似度比较高,相似性都在30%以上。SignalP预测CHU 2268不含信号肽序列但将其在E. coli中进行表达时发现前26个氨基酸残基为疏水区域,可能为其信号肽序列。在E. coli中表达得到活性蛋白并进行性质研究,发现CHU 2268不仅可以降解对硝基苯葡萄糖苷CpNPG)还可以降解pNPC,最终产物都是对硝基苯酚（pNP）和葡萄糖。在CHU₂268降解pNPC时,中间产物为pNPG和葡萄糖,说明CHU 2268以外切方式从非还原端逐个切下葡萄糖。CHU 2268还可以降解纤维二糖和纤维寡糖等,最终产物都是葡萄糖,而且对各种寡糖底物的Km值相近,说明其最适底物为纤维二糖和纤维寡糖,为纤维寡糖酶。对CHU 2268降解纤维寡糖中间产物检测,发现其对纤维寡糖的降解也是逐个切下葡萄糖,为外切方式。并且发现降解过程中有较长链的寡糖产生,说明CHU 2268为具有转糖基活性的纤维寡糖酶。CHU 2268可以与内切纤维素酶协同降解纤维素产生葡萄糖,并且与内切纤维素酶的协同作用远大于β-葡萄糖苷酶与内切纤维素酶的协同作用,可能在C.hutchinsonii纤维素降解过程中起重要作用。4.利用Blue-native PAGE探究C. hutchinsonii膜上的蛋白复合体C. hutchinsonii细胞膜上具有不同种类的纤维素酶,但这些纤维素酶各自单独起作用还是以复合体形式共同作用于纤维素目前还不清楚,对C. hutchinsonii膜上与纤维素酶相互作用蛋白的研究或许可以帮助回答这个问题。Blue-native PAGE （BN-PAGE）是最初是为研究线粒体膜蛋白和蛋白复合体而建立的一种非变性电泳方法,这种方法在分离蛋白复合体的时候可以保持其生物学活性,可以用于蛋白与蛋白间相互作用以及胶内活性检测等方面的研究。将BN-PAGE与SDS-PAGE、活性染色以及蛋白质谱鉴定结合,对膜上的三个蛋白复合体进行了初步鉴定,它们可能分别与葡萄糖代谢以及寡肽的运输利用相关。而且发现C. hutchinsonii膜上有三个β-葡萄糖苷酶活性条带,其中一个β-葡萄糖苷酶可能以复合体形式存在,SDS-PAGE发现里面含有六种不同的蛋白,这些蛋白有待于进一步的质谱鉴定和研究。通过以上研究,对C. hutchinsonii的纤维素酶系有了较为深入地了解。研究发现C. hutchinsonii不依赖外切纤维素酶,而是通过内切纤维素酶、持续性内切纤维素酶、β-葡萄糖苷酶和纤维寡糖酶的协同作用完成对纤维素的降解。对C.hutchinsonii的纤维素酶系的研究为揭示其独特的纤维素降解体系提供了重要依据。