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世界性的能源危机和环境污染使开发可再生清洁能源成为当务之急,其中莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)因其结构简单,遗传背景清晰,培养成本低,生长速度快,氢化酶活性高,能够利用太阳能产生氢气而被认为是非常有开发潜力的生物制氢模式物种。目前利用衣藻制氢的最大瓶颈是氢化酶对氧气特别敏感,使得衣藻氢气产量低,达不到工业化生产的要求,所以如何提高衣藻产氢效率是当前的研究热点,目前国际上从以下三条途径来研究衣藻产氢代谢机理和提高氢气产量：①筛选耐氧的高产氢突变株或改造氢化酶结构使其耐氧②降低细胞内的氧浓度③提高电子传递效率。因为衣藻产氢的代谢机理比较复杂,目前还没有完全研究清楚,筛选衣藻产氢突变株并进行产氢代谢机理的研究还十分必要。本实验室利用对衣藻细胞核基因随即突变的方法得到一个产氢量提高约7倍的突变株,为深入研究衣藻产氢代谢机理提供了一个很好的实验材料。本研究通过分子生物学和生理实验对该突变株产氢有关的代谢特征进行了初步研究,为深入揭示莱茵衣藻产氢代谢机理和利用基因工程手段进一步提高衣藻产氢量提供理论依据和实验基础。本论文的主要内容及结果如下：①对细胞核基因随机突变获得突变株：利用玻璃珠转化法将含有腐草霉素(Zeocin)抗性的ble基因的质粒pSP124S DNA随机插入莱茵衣藻藻种cc849的细胞核基因组中,得到105个具有腐草霉素抗性的突变株藻单克隆。②通过抗生素和气相色谱检测筛选产氢突变株：从具有腐草霉素抗性的转化子中筛选到一株产氢量较高的突变株(暂命名为T1),在600ml体系培养、光照为100μmol·m-2·s-1、完全缺硫条件下,突变株T1的产氢量为3386.4μl·mg-1Chl,而对照组衣藻cc849的产氢量为433.6μl·mg-1Chl,突变株T1的产氢量提高了6.8倍,同时突变株T1产氢培养体系中氧气含量较低,为0.2％,而对照组衣藻cc849的为1.4％。③通过PCR和RT-PCR实验对突变株T1进行了DNA和RNA水平的检测,初步证明外源ble基因成功整合到衣藻细胞核基因组DNA中,并得到正确转录。④通过对突变株T1生长情况的检测表明：在弱光(30μmol·m-2·s-1)和强光(100μmol·m-2·s-1)下突变株T1的生长都未受到抑制。⑤通过对突变株T1的光合放氧活性和呼吸强度检测发现：无论在弱光下还是在强光下,突变株T1的光合强度都比对照组衣藻cc849弱,其最大真实光合速率为18.8μmol/mgchl·h,而对照组衣藻cc849则为31.0μmol/mgchl·h;突变株T1的呼吸速率比对照组衣藻cc849强,为7.01μmol/mgchl·h, cc849的为5.72μmol/mgchl·h,因而突变株T1的P／R值比对照藻849低。⑥通过检测突变株T1的PSⅡ活性发现：突变株T1的PSⅡ活性都比对照藻849低,突变株T1的Fv/Fm值为0.4-0.5,对照组衣藻cc849的Fv/Fm为0.55-0.65；突变株T1的Fv／F0为0.7-1.06,对照组衣藻cc849的Fv/F0为1.45-1.75。⑦检测硫元素对突变株T1产氢的影响,结果表明：无论培养基中硫元素含量为多少,突变株T1的氢气产量都比对照组衣藻cc849的高。且在培养基中完全缺硫的条件下,突变株T1和对照组衣藻cc849的产氢量都达到最高、氧气含量最低,分别为4557μl·mg-1Chl、20μl·mg-1Chl和0％和1.4％(细胞浓度为1.5mg·bottle-1叶绿素)。⑧通过优化产氢培养的光照强度和细胞浓度,结果表明：突变株T1在50ml培养体系中、叶绿素含量为0.5mg·bottle-1、光照强度为30μmol·m-2·s-1时、完全缺硫条件下,氢气产量最高,为7197μl·mg-1Chl,氧气含量占瓶中气体的0.9％。⑨外源碳源和氮源对衣藻产氢的影响：在正常培养基中添加葡萄糖促进了产氢,当添加量为6g·L-1时氢气产量达到最高,为156μl·mg-1Chl；但是在缺硫培养基中添加葡萄糖却没有促进产氢量,当添加甘氨酸和尿素时,无论是正常培养基还是缺硫培养基都促进了产氢量,当在缺硫培养基中添加甘氨酸为2g·L-1氢气产量达到最高,为1391μl·mg-1Chl.