研究背景：随着科学技术的进步，临床诊疗水平的提升，先进医学治疗方法冠状动脉再通术（如冠状动脉介入术、药物溶栓及冠状动脉旁路移植术等）在临床中的成熟应用，使缺血受损心肌能够得到及时再通，显著降低了急性心血管不良事件的致残率与病死率。对缺血心肌进行早期再灌注治疗的益处是不可否定的，不但可使缺血的心肌再次获得生机，将梗死面积降至最小，在临床中若冠状动脉闭塞一定时间后血管再得到灌注，心肌细胞则有一定程度再灌注损伤。部分循证医学资料提示，在心肌梗死后4小时对血管进行再通有时则收获不到预期效果，反而促进了心肌细胞的死亡。多年来学者们已经逐步注意到心肌缺血再灌注时所引发的一系列不良的瀑布式连锁性事件。心肌缺血再灌注损伤是冠状动脉再通后的严重并发症，在心肌缺血再灌注过程中容易导致心肌顿抑、冠状动脉无复流、再灌注性心律失常以及心肌细胞死亡等形式的心肌损伤性改变。目前随着心血管分子生物学研究的深入，已经逐步证实心肌缺血再灌注损伤与心肌细胞凋亡之间的密切关系，在缺血再灌注损伤过程中存在细胞凋亡参与，缺血再灌注损伤能够加速不可逆转性细胞凋亡，且心肌细胞凋亡数量与缺血再灌注损伤持续时间的长短有一定关系。因此可以说心肌缺血再灌注损伤是影响急性冠脉病变预后的不良事件。临床对心肌缺血再灌注损伤时细胞凋亡药物干预是目前研究的焦点。祖国中医药对延续中华民族的千年文明起到了不可取代的作用，不但保证了广大劳动人民的健康与长寿，更为医学界的种种突破发挥着不可磨灭的贡献。中药针对疾病标本同治，且副作用小、纯天然，是我国劳动人民几千年探索的结晶，适合国人的体质，适合国人养生保健与治病强身。诸多临床疾病在西药无计可施之时，学者们也将研究重点转向于中药制剂。分子生物学的进展推动着中药成分及药理机制的研究，单味药物所含成分比较有限，中药复方其所含化学成分比较复杂、药理作用具有多层次、多靶点、多指向、多覆盖的特点，针对临床错综复杂的疾病，中药复方体现出其巨大的临床疗效价值。步长冠心舒通胶囊是咸阳步长制药有限公司研制、开发、推广的国家三类新蒙药，是传统中医药理论知识、临床实践与蒙医蒙药特有理论相结合开发而成。冠心舒通胶囊主要由广枣、丹参、丁香、冰片、天竺黄等药物组成的中药复方制剂，具有活血化瘀、通经活络、行气止痛功能，主要用于治疗胸痹心痛之心血瘀阻证，症见：胸痛、胸闷、心慌、气短；冠心病、心绞痛见上述症候者。广枣为君药具有行气活血、养心、安神之功，用于气滞血瘀、胸痹作痛、心悸气短、心神不安之症；丹参为臣药具有活血调经、祛瘀止痛、凉血消痈、清心除烦、养血安神之效，临床用于治疗月经不调、经闭痛经、症瘕积聚、疮疡肿痛、热痹疼痛、胸腹刺痛、心烦不眠、心绞痛等病；丁香为佐药具有温中降逆、补肾助阳之功，临床用于心腹冷痛、脾胃虚寒、呃逆呕吐、食少吐泻、肾虚阳痿之症；冰片为佐药具有清香宣散、开窍醒神、清热散毒、明目退翳的功效，临床主治热病高热神昏、中风痰厥惊痫、暑湿蒙蔽清窍、喉痹耳聋、口疮齿肿、疮痈疳痔、目赤肿痛、翳膜遮睛。天竺黄为使药，具有清热豁痰、凉心定惊之功用，主治热病神昏谵妄，中风痰迷不语，小儿惊风抽搐，癫痫，痰热咳嗽。在多年临床应用过程中发现冠心舒通胶囊对抑制心肌缺血再灌注损伤细胞凋亡有一定的作用。冠心舒通胶囊的以往研究，均以临床疗效观察或用药经验总结为主，缺乏系统的疗效机制研究，为了明确冠心舒通胶囊对抑制心肌缺血再灌注损伤细胞凋亡作用机理，为该中药复方防治冠心病、改善再灌注损伤心肌功能，降低临床致残率、死亡率，提升患者生活质量，特进行本项研究以期为临床进一步应用提供可靠的理论依据和实验数据。目的：探讨冠心舒通胶囊对大鼠心肌缺血再灌注（I/R）损伤细胞凋亡的影响。材料与方法：1实验动物的饲养1.1分组随机将30只SD级大鼠平均分成3个组别，即假手术组（Sham）、模型组(Model)及冠心舒通胶囊组(Drug)。1.2饲养及处理室内温度维持在18-22摄氏度，湿度维持在（55±2）%。假手术组10只大鼠，给予生理盐水灌胃，每日2次，连续灌服5日；模型组10只大鼠，建立心肌缺血再灌注模型前，给予生理盐水灌胃，每日2次，连续灌服5日；冠心舒通胶囊组10只大鼠，建立心肌缺血再灌注模型前，给予冠心舒通胶囊灌胃，每次按1.5g/Kg，溶于2ml生理盐水中，每日2次灌胃，连续灌服5日。2实验指标测定：2.2.1心肌缺血再灌注模型的制备术前对大鼠行心电图检查并记录Ⅱ导联心电图，对心电图异常的大鼠予以剔除。选用浓度为30g/L戊巴比妥钠腹腔注射对大鼠进行麻醉，用量为1.5ml/kg，大鼠麻醉后进行固定，连接ALC-V型号动物呼吸机，同时记录心电图。随后沿大鼠左锁骨中线纵行剪开胸部皮肤约2厘米，选用5号针线结扎大鼠左冠状动脉的前降支，大鼠心肌梗死模型制备成功的心电图为ST段弓背向上抬高。当每组大鼠在心肌梗死30分钟后，松开结扎线，进行再灌注3小时。假手术组中大鼠只做穿线而不结扎左前降支处理。2.2.2实验取材2.2.2.1摘取大鼠的心脏，使用冰生理盐水进行清洗，摘除血管、脂肪等多余的组织。应用4%的多聚甲醛对大鼠心肌进行固定4小时，再用30%的蔗糖对心肌组织进行脱水（4摄氏度过夜）。2.2.2.2剪下结扎线以下的左心室心肌组织，剪碎后置于玻璃研磨器中，加入蛋白裂解液后进行研磨，静置30分钟。将左心室匀浆于4摄氏度的离心机中，进行时速3000转/分钟，连续离心10分钟，抽取上清液后，再次进行离心，选用12000转/分钟，连续离心30分钟，再次取其上清液，每20微升分装，并在-80摄氏度的冰箱中保存备用。2.2.3观察指标2.2.3.1心肌细胞凋亡指数的检测在每一个标本中各取已制备的切片1张，应用末端脱氧核苷酸转移酶所介导dUTP缺口末端标记法进行标记心肌凋亡细胞核中DNA3-OH的末端，并采用原位荧光法对凋亡细胞进行标记与显示。在荧光显微镜高倍（×200）视野下观察每张切片标本，在心肌梗死区域随机地选择4个视野，并计算凋亡的细胞指数（心肌细胞的凋亡指数%=镜下凋亡心肌细胞总数/镜下总细胞数×100%）。2.2.3.2Western Blot检测Bcl-2、Bax基因蛋白的表达从-80摄氏度的冰箱中将心肌匀浆蛋白取出后，对浆液进行复温，蛋白上清液经过SDS-聚丙烯酰胺凝聚电泳作用下转移至硝酸纤维素膜上，用10%的脱脂奶粉TBST液进行封闭1小时，加入一抗（比例：1:1000）（兔抗鼠bcl-2,bax），在室温下进行孵育2小时后，应用TBST液进行3次洗涤，加入二抗在室温条件下孵育2小时，3次洗涤，经过ECL试剂盒后显色，再对其采用凝聚成像系统进行扫描处理，显色后的结果采用Quality one软件对灰度进行分析，观察并计算蛋白相对的表达水平。结果：1.心肌细胞凋亡指数在200倍的荧光显微镜显示下，在大鼠心肌梗死区域呈现绿色荧光的地带为心肌凋亡细胞主要的分布区域，其中药物干预组大鼠的凋亡细胞数目显著少于模型组，二者统计学具有显著的统计学差异（p<0.01）。2.基因蛋白Bcl-2与Bax的表达水平与假手术组大鼠比较，模型组大鼠基因蛋白Bax表达增强；基因蛋白Bcl-2表达明显减弱，二者具有显著的统计学差异(P<O.01)。与模型组大鼠比较，冠心舒通胶囊干预组大鼠，基因蛋白Bax的表达明显下降，二者比较具有显著的统计学差异（P<O.01)；基因蛋白Bcl-2的表达明显上调，二者比较具有显著的统计学差异(P<O.05)。讨论：机体组织出现缺血后，对缺血组织进行再灌注治疗后，多种因素导致缺血的组织细胞出现代谢功能障碍及结构破坏，从而使组织损害程度进一步加重。人体的许多组织都存在缺血再灌注损伤的现象，尤其是在大脑及心脏。心肌缺血再灌注损伤是多种因素参加的极其复杂的环节，就目前研究表明较为认同的再灌注损伤机制为：氧自由基产生、钙离子超载、心肌细胞能量代谢障碍、炎症细胞激活、内皮细胞功能障碍以及心肌细胞发生凋亡等。心肌缺血再灌注损伤发生过程中心肌细胞的过度凋亡是再一次导致心肌损伤的重要原因，心肌细胞发生凋亡作为缺血再灌注损伤的早期事件，贯穿于缺血再灌注损伤的病理生理过程。细胞凋亡是受基因调控的一种程序性的细胞死亡，参与心肌细胞凋亡的主要调控基因有Bc1-2、p21、Fas、p53、热休克蛋白及caspase家族蛋白酶。根据调控基因的不同功能可以分为三个种类： Bc1-2、lAP、EIB等为具有抑制凋亡功能的基因；Fas、p53、Bax等为具有促凋亡功能的基因；C-myc、Bcl家族等为具有双向调控功能的基因。目前研究中，受关注程度最多、功能较明确的具有抑制凋亡功能的基因为Bc1-2，促进细胞凋亡的基因为Bax。基因蛋白Bcl-2及Bax是Bcl-2基因蛋白家族中作用互为对立的重要的调控细胞凋亡基因，Bcl-2对细胞凋亡起抑制作用，Bcl-2高度表达对于线粒体内钙离子稳态起到了维持作用，对线粒体膜电位下降起到阻止作用，并抑制线粒体膜通透性转换孔开放，抑制促进凋亡蛋白质如凋亡诱导因子、细胞色素C的释放，从而防止细胞发生凋亡。Bcl-2还能够与Apaf-1及Caspase9进行结合，并维持Bcl-2的非活化状态，阻断Caspase的级联反应，从而抑制细胞的凋亡。基因蛋白Bax对细胞的凋亡起到促进作用。部分研究结果尚提示，调节心肌细胞凋亡的基因水平不仅仅取决于基因蛋白Bcl-2及Bax自身水平的表达高低，还与基因蛋白Bcl-2及Bax水平比值有关，基因蛋白Bcl-2及Bax的比值反映了细胞出现凋亡的程度。冠心舒通胶囊以广枣、丹参、丁香、冰片、天竺黄等中药药材以一定的比例所组成，是在现代中医药理论与蒙医蒙药理论相互贯通结合的基础上开发研制所成，冠心舒通胶囊有活血化瘀、通经活络、行气止痛的功效。中药广枣及丹参的药理作用均有多种，例如对实验动物的外周微循环具有改善作用、对炎症反应起到抑制作用以及抗氧化作用等。本实验研究主要通过用药后制备心肌缺血再灌注损伤的模型后，检测大鼠心肌细胞的凋亡指数与基因蛋白Bcl-2及Bax的表达水平，实验结果表明，与假手术组大鼠相比较，模型组大鼠基因蛋白Bax的表达增强，基因蛋白Bcl-2的表达明显降低；与模型组大鼠相比，冠心舒通胶囊组大鼠，心肌细胞凋亡指数、基因蛋白Bax的表达明显下降，基因蛋白Bcl-2的表达明显上调。本实验研究最终证实，冠心舒通胶囊能够明显降低缺血再灌注损伤的心肌细胞发生凋亡，从而表明其具有抗心肌缺血再灌注损伤的作用。结论：冠心舒通胶囊可以通过抑制心肌细胞的凋亡，下调基因蛋白Bax表达，上调基因蛋白Bcl-2表达，在心肌缺血再灌注损伤时起到保护心肌细胞的作用。