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第一章生化异常期早发性卵巢功能不全患者外周血和颗粒细胞中端粒稳态分析目的:早发性卵巢功能不全(POI)是女性生育力的一种病理性衰老。按照疾病的发展进程,临床上将POI分为4个阶段:正常期、隐匿期、生化异常期和临床异常期。端粒稳态是指端粒长度和端粒酶活性的相互调节和平衡,是反映衰老程度的重要指标之一。端粒损耗与年龄及多种衰老相关疾病之间存在一定关系。前期研究提示端粒稳态与隐匿期和临床异常期POI均具有相关性,但端粒稳态与生化异常期POI是否具有相关性目前未见报道。本研究拟通过测定生化异常期POI患者外周血端粒长度、结合颗粒细胞端粒长度及端粒酶活性探讨端粒稳态与早期卵巢功能衰退的相关性。方法:纳入在山东大学附属生殖医院就诊的生化异常期POI患者120例和正常对照女性279例。留取外周血和卵泡液,提取卵泡液中颗粒细胞。通过改良的定量聚合酶链反应技术测定外周血和颗粒细胞相对端粒长度,采用改进的端粒重复序列延伸法测定颗粒细胞中相对端粒酶活性,比较分析病例和对照组中端粒长度和端粒酶活性差异。结果:在校正年龄因素的影响后,生化异常期POI患者外周血(0.75 ±0.09 vs.1.79±0.12,P<0.001,OR = 0.54,95%置信区间(CI)= 0.43-0.68)和颗粒细胞(0.78±0.09vs.1.90±0.23,P<0.001;OR = 0.54,95%CI = 0.41-0.70)端粒长度均明显短于正常对照。POI患者颗粒细胞端粒酶活性明显低于正常对照(1.57±0.59vs.4.63 ±0.93,P = 0.025;OR = 0.84,95%CI = 0.72-0.98)。差异均有统计学意义。结论:首次在生化异常期POI患者中同时测定了外周血和颗粒细胞中的端粒长度以及颗粒细胞中的端粒酶活性,发现缩短的端粒长度和降低的端粒酶活性和生化异常期POI密切相关,提示端粒长度和端粒酶活性或可作为监测卵巢功能进行性下降的指标之一。第二章 FAM175A基因在早发性卵巢功能不全发病中的机制研究目的:早发性卵巢功能不全(POI)病因高度异质,目前已知病因包括染色体异常、基因突变、自身免疫、医源性因素、感染、代谢性因素以及环境因素等,但半数以上的患者病因并不明确,目前已知的POI致病基因包括生殖激素合成相关、卵子发生相关、以及影响卵巢功能的多效性孟德尔遗传疾病相关基因等。近来,有研究证实DNA损伤修复相关基因突变是POI的致病原因。FAM175A基因是重要的DNA损伤修复相关基因,参与DNA损伤的抵抗和修复过程,以及G2-M细胞周期检验点的调控。Fam175a基因敲除的纯合子和杂合子小鼠,均表现出生存率的降低和肿瘤发生率的增加,但研究者并未观察小鼠的生育能力。一项纳入22个GWAS结果的Meta分析发现13个与女性自然绝经年龄相关的新发SNP位点,后续的生物学通路分析发现其中的SNPrs4693089与FAM175A基因紧密连锁在一起。FaM175A基因突变与POI发病机制的相关研究目前未见报道。本研究对特发性POI患者进行FAM175A基因测序分析,并探讨该基因突变与POI发病的相关性。方法:纳入400例特发性POI患者和400例卵巢功能正常的妇女。对POI患者的FAM175A基因外显子部分及外显子和内含子交接区域进行测序,发现的序列变异在400例对照中进行验证。为阐明发现突变对FAM175A基因功能的影响,进一步利用丝裂霉素诱导DNA双链断裂损伤,检测磷酸化H2AX水平,评估DNA损伤敏感性及修复能力;流式细胞仪检测有丝分裂期细胞比例,评估G2-M检验点调控能力。结果:测序发现2例患者同时携带FAM175A基因的杂合突变C.C727G(p.L243V),在Hela细胞中过表达野生型以及p.L243V突变型FAM175A,丝裂霉素诱导损伤后,突变型细胞对损伤的敏感性以及修复能力较野生型细胞未发现明显变化,两种细胞的G2-M检验点调控能力也未见显著差异。结论:首次在特发性POI患者中进行了FAM1 75A基因突变筛查,并发现FAM175A基因突变c.C727G(p.L243V),但该突变未影响FAM175A对DNA损伤的敏感性及修复能力,可能不是POI患者的发病原因。第三章 TLK1基因在早发性卵巢功能不全发病中的机制研究目的:TLK1基因隶属DNA损伤修复基因家族,通过RAD9-TLK1-ASF1通路参与DNA双链断裂损伤修复,并通过调节染色质动力学参与调控染色质装配。既往全基因组关联荟萃分析报告了 13个新发自然绝经年龄相关位点,其中包括TLK1在内的涉及DNA损伤修复的8个候选基因。进一步研究证实,TLK1基因rs10183486位点与欧洲女性的早绝经和POI有关。但TLK1是否参与以及如何参与POI发病目前未见报道。方法:研究共纳入192例特发性POI患者,对TLK1基因外显子及外显子与内含子交接部分进行直接测序,测序结果与数据库中正常中国北方(CHB)人群进行基因型和等位基因频率比较,SPSS软件进行统计分析。结果:192例特发性POI患者筛查出6个已知SNP位点,分别为位于8号外显子的 rs149844334,rs11553951 和 rs771244101;位于 21 号外显子的 rs2277339;位于1号内含子区域的rs113416007和位于6号内含子区域的rs17283147。其中前4个位于外显子上的SNP均为同义突变。未发现TLK1的新发变异。结论:首次在中国POI患者中进行了TLK1基因突变分析,未发现致病突变,提示TLK1基因突变可能不是中国POI患者发病的常见病因。TLK1基因对POI的致病性有待进一步探讨。